Functional phenotyping of macrophage subsets during skeletal muscle regeneration and in degenerative myopathies

par Marielle Saclier

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire

Sous la direction de Bénédicte Chazaud.

Le président du jury était Sophie Lotersztajn.

Le jury était composé de Bénédicte Chazaud, Sophie Lotersztajn, Valérie Allamand, Jérôme Frenette, François Rivier.

Les rapporteurs étaient Valérie Allamand, Jérôme Frenette.

  • Titre traduit

    Phénotypes fonctionnels des sous populations de macrophages au cours de la régénération musculaire et lors des myopathies dégénératives


  • Résumé

    Le muscle squelettique a la capacité de se régénérer suite à une lésion grâce aux cellules satellites qui sont les cellules souches du muscle. Après dommage musculaire, les cellules satellites s’activent, prolifèrent, se différencient et fusionnent afin de reformer le muscle lésé. Cependant les cellules myogéniques ne sont pas les seules cellules impliquées dans la régénération musculaire. Des études précédentes réalisées au laboratoire ont montré chez la souris que les macrophages sont des cellules essentielles à la régénération musculaire. En effet, peu de temps après un dommage musculaire, les monocytes infiltrent le tissu lésé et se différencient en macrophages pro-inflammatoires Ly6Cpos (M1). Ces macrophages stimulent la prolifération des myoblastes et inhibent leur fusion. Puis les macrophages pro-inflammatoires changent de phénotype et deviennent des macrophages anti-inflammatoires Ly6Cneg (M2) qui stimulent la différenciation des myoblastes et les protègent de l’apoptose. Ainsi, en fonction de leur phénotype, les macrophages exercent des rôles trophiques séquentiels sur les myoblastes tout au long du processus de régénération musculaire. Dans la première partie de notre étude, nous montrons in vitro que les macrophages humains soutiennent les différentes étapes de la myogenèse. Les macrophages M1 sont fortement attirés par les myoblastes. De plus ils stimulent la prolifération des myoblastes et inhibent leur fusion. Les macrophages M2 attirent les myoblastes et stimulent leur différenciation permettant ainsi la formation de larges myotubes. En utilisant des anticorps bloquants spécifiques, nous avons identifié plusieurs molécules sécrétées par les macrophages régulant la myogenèse chez l’homme. Nos analyses in vivo chez l'homme confirment nos résultats obtenus in vitro. En effet, les macrophages M1 sont préférentiellement associés aux aires de régénération contenant des myoblastes non différenciés alors que les macrophages M2 sont associés aux aires de régénération contenant des myoblastes en différenciation. Dans un contexte de myopathie dégénérative, nous avons montré que les macrophages adoptent des phénotypes et des fonctions totalement différents des macrophages présents au cours de la régénération musculaire. Nous avons observé chez la souris et chez l’homme, que les macrophages exprimant des marqueurs M1 sont associés à la fibrose et qu’un traitement anti-inflammatoire réduit leur nombre dans le muscle dystrophique murin. Par isolement spécifique et cocultures ex vivo, nous avons montré qu'au cours de la régénération musculaire, les macrophages Ly6Cneg stimulent la production de collagène par les fibroblastes. A l'inverse au cours des myopathies dégénératives, ce sont les macrophages Ly6Cpos qui stimulent fortement l’établissement de la fibrose en agissant directement sur les fibroblastes. De plus, ces macrophages Ly6Cpos, qui régulent négativement les fibroblastes au cours de la régénération musculaire, stimulent la différenciation des fibroblastes et myofibroblastes dans les myopathies. De plus, ils les protègent de l'apoptose, participant ainsi à la persistance de ces cellules fibrosantes. Ainsi, nous avons confirmé chez l’homme in vitro et in vivo, le rôle de support séquentiel des macrophages au cours de la régénération musculaire. De plus, nous avons identifié différents effecteurs sécrétés par les macrophages M1 et M2 impliqués dans la régulation du processus myogénique chez l'adulte. Nous avons également montré que lors des myopathies dégénératives et au cours de la régénération musculaire, les macrophages adoptent un phénotype et des fonctions totalement différents, avec notamment un rôle profibrotique des macrophages pro-inflammatoires.


  • Résumé

    Skeletal muscle has the ability to regenerate after a chemical or physical injury thanks to satellite cells, the muscle stem cells. After damage, satellite cells proliferate, differentiate and fused to reform muscle. Myogenic cells are not the only on cells involved. Previous studies in the laboratory showed that, in mice, macrophages are crucial for skeletal muscle regeneration. Soon after an injury, macrophages infiltrate damaged muscle and differentiate into Ly6Cpos pro-inflammatory (M1) macrophages. They stimulate proliferation of myoblasts and inhibit their fusion. Then, pro-inflammatory macrophages skew towards a Ly6Cneg anti-inflammatory phenotype (M2). Anti-inflammatory macrophages stimulate differentiation of myoblasts and protect them from apoptosis. Thus, depending on their phenotype, macrophages exert sequential trophic roles on myoblasts throughout muscle regeneration. Here, we showed in vitro that human macrophages also support different steps of myogenesis. M1 macrophages are strongly attracted by mpcs. Moreover, they secrete molecules, which stimulate proliferation of mpcs and inhibit their fusion. M2 macrophages attract mpcs and stimulate differentiation of mpcs in order to form large myotubes. Using specific blocking antibodies, we identified molecules involved in the regulation of myogenesis by M1 and M2 macrophages in a human in vitro system. In vivo analysis of regenerating human muscle sections confirmed our results obtained in vitro. M1 macrophages are preferentially associated with proliferating myogenic cells while M2 macrophages are associated with differentiating myogenic cells. In degenerative myopathies, we showed that macrophages are completely different from those present during skeletal muscle regeneration. We observed in mouse and human that M1 marker-expressing macrophages are associated with fibrosis while anti-inflammatory treatment reduced this population, in association with an improvement of the dystrophic muscle. Isolated Ly6Cneg macrophages exhibit a mixed M1/M2 phenotype. In ex-vivo coculture experiments, we showed that Ly6Cpos macrophages strongly favor establishment of fibrosis by directly acting on fibroblasts while in regenerating muscle, these Ly6Cpos macrophages negatively regulate fibrosis. To resume, we confirm in human the supportive sequential roles of macrophages during skeletal muscle regeneration in vitro and in vivo. Moreover, we identified effectors secreted by M1 and M2 macrophages involved in the regulation of the myogenic process. We also highlight that during muscle regeneration and in degenerative myopathies, macrophages exhibit different phenotype associated with opposite functions, with a pro-fibrotic role for pro-inflammatory macrophages.


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