Internalisation cellulaire et activité biologique de PNA bloqueurs stériques de la traduction, conjugués au peptide (R/W)9

Cellular internalization and biological activity of steric blocker PNA of translation, conjugated to the (R/W)9 peptide

• Auteur / Autrice : Céline Cordier
• Direction : Tula Saison-Behmoaras
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 23/01/2014
• Etablissement(s) : Paris 5
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Régulation et dynamique des génomes
• Jury : Président / Présidente : Michel Vidal
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Tula Saison-Behmoaras, Michel Vidal, Claude Malvy, Sandrine Sagan, Virginie Escriou, Jean-Jacques Toulmé
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Claude Malvy, Sandrine Sagan

Mots clés

Mots clés contrôlés

Récepteur IGF de type 1

Peptides de pénétration cellulaire

Acides nucléiques peptidiques

Mots clés libres

Peptide Nucleic Acids

Peptides vecteurs

Internalisation

Élongation de la traduction

Libération endosomale

Peptide Nucleic Acids

Cell Penetrating Peptides

Internalization

Translation elongation

Endosomal escape

Résumé

Les Peptide Nucleic Acids (PNA) sont des oligonucléotides antisens analogues de l’ADN, dont le squelette phosphodiester a été remplacé par un squelette pseudo-peptidique d’unités 2-aminoéthylglycine, sur lequel sont greffées des bases azotées. Des PNA dirigés contre les ARN messagers peuvent inhiber la traduction in vitro et dans les cellules humaines. Lorsqu’ils sont dirigés contre la partie codante du transcrit, des PNA polypyrimidiques peuvent bloquer physiquement l’élongation de la traduction en stoppant la machinerie ribosomale. Le transcrit n’est pas dégradé et une protéine tronquée est générée in vitro. Dans le cas de protéines dont la surexpression conduit à des pathologies, des protéines tronquées inactives peuvent jouer un rôle de dominant négatif dans les cellules. Des protéines tronquées de l’Insulin-like Growth Factor-1 (IGF1R), récepteur cellulaire surexprimé dans de nombreux cancers, inhibent la tumorigénèse et la résistance à l’apoptose de cellules cancéreuses. La pénétration cellulaire des PNA est la principale limite à leur utilisation in vivo et il est nécessaire de développer des transporteurs efficaces pour ces oligonucléotides neutres. Les Cell Penetrating Peptides (CPP) sont des peptides naturels ou synthétiques, qui peuvent être conjugués à différentes molécules pour promouvoir leur internalisation cellulaire. Les objectifs de ce travail de thèse étaient de comprendre les critères requis pour l’arrêt de l’élongation de la traduction par les PNA et d’étudier leur internalisation cellulaire médiée par le CPP (R/W)9. Nous avons montré qu’un couplage covalent entre ce peptide et deux PNA 13-mer permet l’internalisation des conjugués dans un système cellulaire rapporteur, conduisant à leur activité biologique en présence d’un agent lysosomotropique. Les conjugués interagissent avec les glycosaminoglycanes membranaires et sont internalisés par endocytose en moins d’une heure. De plus, les conjugués formés avec un peptide analogue comportant des lysines sont six fois moins internalisés, mettant en évidence l’importance des résidus arginines du peptide (R/W)9 pour l’interaction avec la membrane. Enfin, nous avons montré que le peptide (R/W)9 couplé à un PNA dirigé contre la séquence codante de l’IGF1R permet son internalisation dans les cellules de cancer de la prostate et que le conjugué inhibe spécifiquement l’expression de la chaîne β du récepteur.

Peptide nucleic acids (PNAs) are nucleic acid analogues in which the sugar-phosphate backbone has been replaced by a synthetic peptide backbone, usually comprised of N-(2-aminoethyl)-glycan units. PNAs targeted against mRNA can inhibit translation both in vitro and in human cells. Pyrimidine rich PNAs can physically block translation elongation at targets in the coding region of messenger RNA, giving rise to a truncated protein. Truncated proteins that lack a functional domain and can at the same time inhibit the function of the wild type protein are referred to as dominant negative. Truncated form of Insulin-like Growth Factor-1 receptor (IGF1R), protein overexpressed in numerous cancers, inhibits tumorigenesis and resistance to apoptosis of cancerous cells. One of the biggest limitations to the use of PNAs in vivo is their poor internalization. It is therefore necessary to develop efficient transporters able to enhance the cellular uptake of PNAs. Cell-penetrating peptides (CPPs) are natural or synthetic peptides that can be conjugated to different molecules in order to facilitate their cellular uptake. The objectives of this thesis were to understand the conditions required for the translation elongation arrest by PNAs and to study their cellular internalization mediated by CPP (R/W)9. We have shown that covalent coupling of two 13-mer PNAs to (R/W)9 facilitates their internalization in a reporter cell line, leading to their biological activity in the presence of a lysosomotropic agent such as chloroquine. The conjugates interact with membrane glycosaminoglycans and are internalized by endocytosis in less than one hour. Moreover, conjugates formed with an analogue peptide containing lysines in the place of arginines of (R/W)9 showed to be six time less efficiently internalized, suggesting the importance of arginine residues for the interaction of the conjugate with the membrane. We have also showed that the PNA targeted to the coding region of IGF1R coupled to (R/W)9 is efficiently internalized to prostate cancer cells where it inhibits the expression of the beta chain of the receptor.