Rôle du Rho-GEF Trio dans la division cellulaire

par Aude Cannet

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Anne Debant.

Le jury était composé de Anne Debant, Jacques Bertoglio, Arnaud Echard, Bénédicte Delaval, Anne Royou.

Les rapporteurs étaient Jacques Bertoglio, Arnaud Echard.


  • Résumé

    Durant la division cellulaire, la cellule subit des changements importants dans sa forme et son adhésion qui dépendent de l'efficacité du remodelage du cytosquelette d'actine. Ce processus est localement et temporellement régulé pour assurer le bon déroulement de la cytokinèse, l'étape finale de la division cellulaire. Il est contrôlé par les GTPases de la famille Rho via le remodelage du cytosquelette d'actine. Les Rho-GTPases fonctionnent comme des interrupteurs moléculaires, passant d'une forme au repos (liée au GDP) à une forme active (liée au GTP). La forme au repos interagit avec des facteurs d'échange, les GEFs (Guanine nucleotide Exchange Factors) qui déplacent le GDP et permet la fixation du GTP. Le retour à la forme inactive se fait par hydrolyse du GTP en GDP, stimulée par les protéines GAPs (GTPase Activating Proteins). RhoA est un régulateur positif de la cytokinèse, activée spécifiquement à l'équateur de la cellule, et qui promeut l'assemblage et la constriction de l'anneau d'actomyosine. En contraste, Rac1 a été proposée pour réguler négativement ce processus et doit être inactivée spécifiquement à l'équateur de la cellule pour le bon déroulement de la cytokinèse. Ainsi, une GAP de Rac1, MgcRacGAP, qui est localisé sur le fuseau central de microtubules, inactive Rac1 à l'équateur de la cellule. La déplétion de MgcRacGAP induit des défauts de cytokinèse qui peuvent être sauvés en co-déplétant Rac1. Cependant, le Rho-GEF activant Rac1 durant la division cellulaire n'a pas encore été identifié. Pour identifier un GEF régulant l'activité de Rac1 dans les cellules en division, nous avons réalisé une approche de « screening » par siRNA dans les cellules HeLa. Les Rac-GEFs sont déplétés par siRNA seul ou en combinaison avec un siRNA ciblant MgcRacGAP, dans le but d'identifier lesquels sont capables de sauver le nombre de cellules multinuclées induit par la déplétion de MgcRacGAP. De façon intéressante, la co-déplétion de MgcRacGAP et du Rho-GEF Trio, un GEF caractérisé principalement pour son rôle dans la croissance et le guidage axonal, entraîne une forte diminution du nombre de cellules multinuclées. Par la suite, nous démontrons que ce sauvetage du phénotype passe par la voie Trio-Rac1 en utilisant des mutants GEFs inactifs de Trio et un inhibiteur spécifique de l'activation de Rac1 par Trio. Ces résultats et le rôle de MgcRacGAP dans l'inactivation de Rac1 en cytokinèse, suggèrent que la déplétion de Trio pourrait sauver les défauts de cytokinèse induits par la déplétion de MgcRacGAP en diminuant l'activité de Rac1. Cela suggère aussi que Trio pourrait être un GEF de Rac1 dans les cellules en division. Pour directement tester si Trio pouvait fonctionner comme un GEF de Rac1 dans les cellules en division, la quantité de Rac1 a été mesurée par « pull-down assay » dans des cellules synchronisées en mitose. Comparé aux cellules traitées avec un siRNA contrôle, la déplétion de Trio réduit de moitié la quantité de Rac1 activée dans les cellules en mitose, démontrant que Trio active Rac1 en mitose. De plus, la déplétion de Trio induit des défauts de remodelage du cytosquelette d'actine dans les cellules en anaphase. De façon intéressante, la déplétion de Trio phénocopie la déplétion de Rac1 et de son effecteur Arp2/3, en accord avec un rôle de la voie Trio-Rac1 dans le contrôle du remodelage du cytosquelette d'actine dans les cellules en division. L'ensemble de ce travail a permis d'identifier pour la première fois un GEF contrôlant l'activité de Rac1 dans les cellules en division dont l'activité s'oppose à la fonction de MgcRacGAP en cytokinèse. Nous proposons ainsi un modèle dans lequel Trio contrôle l'activation de Rac1 et le remodelage du cytosquelette d'actine au cortex cellulaire dans les cellules en division. Dans notre modèle, MgcRacGAP s'oppose à l'action de Trio en inhibant localement et temporellement l'activation de Rac1 au plan de division, assurant ainsi le bon déroulement de la cytokinèse.

  • Titre traduit

    Role of Rho-GEF Trio in the cell division


  • Résumé

    During cell division, cells undergo dramatic changes in shape and adhesion that depend on efficient actin cytoskeleton remodeling. This process has to be locally and temporally regulated to accurately ensure cytokinesis, the final stage of cell division. The small GTPases Rac1 and RhoA play an essential role in this process by controlling F-actin cytoskeleton remodeling. GTPases oscillate between an inactive, GDP-bound state and an active, GTP-bound state. They are activated by Guanine-nucleotide Exchange Factors (GEFs), which stimulate the GDP-to-GTP exchange, while they are turned off by GTPase-Activating Proteins (GAPs) which catalyse the hydrolysis of GTP. RhoA is a positive regulator of cytokinesis specifically activated at the division plane, which promotes the assembly and constriction of the actomyosin network. In contrast, Rac1 has been proposed to negatively regulate this process and has to be inactivated at the division plane for cytokinesis to occur properly. A central spindle localized GAP, MgcRacGAP, component of the centralspindlin complex, controls Rac1 inactivation at the cleavage plane. Depletion of Rac1 can suppress the cytokinesis failure induced by MgcRacGAP depletion. However, the Rho-GEF that activates Rac1 during cell division has not been identified yet. To identify a GEF regulating Rac1 activity in dividing cells, we performed a siRNA screening approach in HeLa cells. Rac-GEFs were depleted by siRNA alone or in combination with MgcRacGAP siRNAs, in order to identify the ones able to rescue the multinucleated cells induced by MgcRacGAP depletion. Importantly, co-depletion of MgcRacGAP and Rho-GEF Trio, a GEF characterized primarily for its role in axon outgrowth and guidance resulted in a strong decrease in the number of multinucleated cells. Then, we demonstrate that this rescue is mediated by the Trio-Rac1 pathway, using GEF dead mutants of Trio and a specific inhibitor of Rac1 activation by Trio. These data and the fact that MgcRacGAP was recently described to be essential for Rac1 inactivation in cytokinesis, suggest that Trio depletion could rescue the cytokinesis failure induced by MgcRacGAP depletion by decreasing Rac1 activity. It therefore suggests that Trio could be a GEF of Rac1 in dividing cells. To directly test if Trio could function as a GEF of Rac1 in dividing cells, the amount of activated Rac1 was monitored by pull down assay in synchronized mitotic cells. Compared to control siRNA-treated cells, Trio depletion reduced by half the amount of activated Rac1 in mitotic cells, showing that Trio activates Rac1 in mitosis. Strikingly, Trio depletion led to defects in F-actin cytoskeleton remodeling in anaphase cells. Indeed, the F-actin staining at the cortex was significantly reduced in Trio-depleted cells compared to control cells. Interestingly, Trio depletion phenocopied the depletion of Rac1, consistent with a role for the Trio-Rac1 pathway in controlling F-actin remodeling in dividing cells.Overall, this work identifies for the first time a GEF controlling Rac1 activation in dividing cells that counteracts MgcRacGAP function in cytokinesis. Based on these observations, we propose a model in which Trio functions as a GEF of Rac1 during cell division. Trio, which is expressed throughout the cell cycle, activates Rac1 to control F-actin cytoskeleton remodeling at the cell cortex of dividing cells. MgcRacGAP therefore counteracts the action of Trio by locally and temporally inhibiting Rac1 activation at the division plane, subsequently ensuring accurate cytokinesis.

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