Impact de l'haploinsuffisance d'ATR/CHK1 et de la Topoisomérase 1 sur la réplication et les Sites Fragiles Communs.

par Delphine Lemaçon

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Arnaud Coquelle.

Le président du jury était Philippe Pasero.

Le jury était composé de Arnaud Coquelle.

Les rapporteurs étaient Jean-Sébastien Hoffmann, Olivier Brison.


  • Résumé

    Les Sites Fragiles Communs (SFCs) sont des points de cassures chromosomiques récurrents survenant suite à un stress réplicatif. La majorité d'entre eux ont été identifiés suite à un traitement à l'Aphidicoline (APC), un inhibiteur des ADN polymérases, ce qui explique pourquoi l'étude de leur fragilité est majoritairement basée sur des perturbations de la réplication. Parmi les facteurs impliqués dans la fragilité, ATR (Ataxia Telangiectasia and Rad3 Related), une kinase engagée dans la signalisation des fourches de réplication bloquées, et sa cible CHK1 (Checkpoint Kinase 1), induisent l'apparition de cassures aux SFCs lorsqu'ils sont déplétés dans la cellule. Cependant, ces gènes sont difficiles à étudier car leur déplétion totale est létale pour les cellules. Nous avons donc choisi de développer un modèle basé sur l'utilisation de la lignée MSI de cancer colorectal HCT116de laquelle nous avons isolé des clones haploinsuffisants pour ATR ou CHK1.Ces mutations sont naturelles et sont d'ailleurs dans les cancers MSI. Aujourd'hui, de nouvelles données montrent que la transcription semble aussi être impliquée dans l'induction de certains SFCs. Pour étudier ce mécanisme, nous nous sommes servis de cellules déficientes pour la Topoisomérase 1 (Topo1) grâce à un shARN inductible. Cette protéine est impliquée dans la gestion des interférences entre les machineries de réplication et de transcription et son inhibition est à l'origine d'une forte instabilité chromosomique.Nos études démontrent tout d'abord que l'haploinsuffisance d'ATR ou de CHK1 retrouvée dans les cancers MSI génère des défauts de réplication, des problèmes de checkpoints ainsi que des cassures ADN et en particulier au niveau des SFCs. Une déficience en Topo1 induit aussi l'apparition de problèmes de réplication et une plus grande fragilité ADN, mais elle est aussi capable d'induire des cassures au niveau de certains SFCs, connus pour être sensible à des défauts de réplication. Une étude plus approfondie du SFC le plus fréquemment induit, FRA3B, montre qu'il est sensible à la fois à des défauts dans la voie ATR/CHK1, au stress réplicatif induits par l'aphidicoline mais aussi à la déficience en Topo1. Nos travaux suggèrent que l'haploinsuffisance d'ATR et CHK1 peut favoriser la cancérogenèse à travers l'induction des SFCs et que tous les SFCs n'ont pas les mêmes mécanismes d'induction, laissant la porte ouverte pour l’identification de nouveaux SFCs.

  • Titre traduit

    Impact of ATR/CHK1 haploinsufficiencies and Topoisomerase 1 on replication and Common Fragile Sites induction.


  • Résumé

    Common Fragile Sites (CFSs) are recurrent chromosomal breakpoints occurring when cells are exposed to replicative stress. Most CFSs have been identified following Aphidicolin (APC) treatment, an inhibitor of DNA polymerase and therefore the working model to explain their fragility is indeed mainly based on perturbation of replication. Among the key actors involved in fragility, ATR (Ataxia Telangiectasia and Rad3 Related), a kinase involved in stalled replication fork signaling, and its target CHK1 (Checkpoint Kinase 1), lead to enhanced chromosome fragility when transiently depleted in cells. However, ATR and CHK1 are difficult to study since their complete depletion is lethal for the cells. We have developed a colorectal cancer HCT116 MSI model harboring ATR or CHK1 haploinsufficient mutations found in MSI cancers. Transcription also seems to be involved in the induction of SFCs. To investigate this mechanism, we created topoisomerase 1 (Topo1) deficient cells with inducible shRNA. This protein is involved in interference between replication and transcription and its inhibition is associated with high chromosomal instability. Our studies indicate that ATR or CHK1 haploinsufficiency found in MSI cancers causes replication and checkpoints defects and induces DNA break particularly at CFSs. Topo1 deficiency is responsible of replication defects and DNA fragility and it induces breaks at some CFSs already known to be sensitive to replication defects. Moreover, a precise study of the most induced CFSs, FRA3B, shows that it is sensitive to defects in ATR/CHK1 pathway, to replicative stress induced by aphidicolin but also to Topo1 deficiency. Our results suggest that ATR and CHK1 haploinsufficiency can promote carcinogenesis through the induction of CFSs. Futhermore, we suggest that all CFSs do not rely on the same induction mechanisms, letting us to postulate that new CFSs are still to be identified.

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