Techniques modernes de diagnostic paraclinique non invasif du déficit en cellules souches limbiques : comparaison, développement, recommandations

par Muriel Poli

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et oncologie

Sous la direction de Odile Damour.

Soutenue le 17-10-2014

à Lyon 1 , dans le cadre de École Doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon) , en partenariat avec Groupement hospitalier Édouard Herriot (Lyon). Laboratoire des Substituts Cutanés (laboratoire) et de Groupement Hospitalier Edouard Herriot Hospices Civils de Lyon (laboratoire) .

Le président du jury était Carole Burillon.

Le jury était composé de Philippe Sourdille, Dominique Sigaudo-Roussel.

Les rapporteurs étaient Pierre-Jean Pisella, Frédéric Chiambaretta.


  • Résumé

    Optimiser le diagnostic paraclinique prédictif et non invasif du déficit en cellules souches limbiques (DCSL) : in vitro après empreinte cytologique (EC) par la recherche immunohistochimique (IH) de marqueurs pertinents et par reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), technique de haute sensibilité ; in vivo par microscopie confocale (MCIV). Matériel et Méthodes: La preuve diagnostique de DCSL est la présence de cellules conjonctivales au sein de la cornée, la persistance de cellules cornéennes signant un DCSL partiel. L'EC a été standardisée. La spécificité de chacun des marqueurs cornéens ou conjonctivaux sélectionnés a été recherchée sur des tissus normaux avant d'aborder une étude prospective monocentrique, sur 22 yeux de 18 patients cliniquement suspects de DCSL. Les cellules épithéliales de la cornée centrale étaient recueillies par EC puis transférées sur lame. L'expression des marqueurs de différentiation conjonctivale (K7, K13, K19, MUC5AC) et cornéenne (K12) a été recherchée par IH sur les 22 EC et celle de la MUC5AC par RT-PCR sur 4 d'entre elles. Enfin, la cornée et le limbe de 7 patients ont étés analysés par MCIV. La concordance entre les techniques est évaluée. Conclusion: Ces techniques complémentaires dépendent de l'équipement du service et de l'accessibilité à un laboratoire compétent. Un organigramme décisionnel a été établi pour permettre de faire un diagnostic fiable de DCSL, les examens paracliniques étant inutiles dans certains cas. La recherche IH de kératines conjonctivales K7/K13 et/ou la détection de MUC5AC par RT-PCR sur cellules cornéennes recueillies par EC sont des techniques diagnostiques de haute valeur scientifique, tandis que l'IH K12/MUC5AC doit être abandonnée pour manque de sensibilité et celle de K3/K19 pour manque de spécificité. La MCIV, quand elle est réalisable, est une technique hautement sensible qui permet une quantification du degré de sévérité de la maladie avec une forte concordance avec les autres examens

  • Titre traduit

    New minimally invasive techniques for diagnosing limbal stem cell deficiency : comparison, development and recommendations


  • Résumé

    Purpose: to optimize minimally invasive techniques for diagnosing limbal stem cell deficiency: in vitro after impression cytology (IC) by means of immunocytochemical detection of relevant markers and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT PCR), an highly sensitive method; in vivo by confocal microscopy (IVCM). Material and Methods: Presence of conjunctival cells in central cornea was diagnosis proof of LSCD, whereas corneal epithelial cells’ remaining traduces partial LSCD. IC was labeled. Corneal or conjunctival specificity of each marker was previously assessed on healthy tissues. In a prospective case control observational study, 22 eyes of 18 patients clinically suspected of LSCD were enrolled. Epithelial cells from central cornea were collected by IC. Conjunctival (K7, K13, K19, MUC5AC) and corneal (K12) differentiation markers were assessed by immunocytochemistry on each of 22 eyes and MUC5AC RT-PCR was assessed for 4 of them. Cornea and limbus of 7 eyes were assessed by IVCM. The inter-examination agreement was determined. Conclusion: These techniques require skilled technicians and laboratory facilities. We propose a decision tree model to provide unfailing LSCD diagnosis, complementary examinations being sometimes useless. Clinical examination can lead to LSCD misdiagnosis. Immunostaining of conjunctival keratins K7 and K13 as well as MUC5AC detection by RT-PCR are highly effective methods whereas MUC5AC/K12 immuno staining are not sensible and both K3 and K19 are not specific. IVCM of great sensitivity if realizable allows quantification of LSCD severity. Combining both methods provides in every case unfailing diagnosis of LSCD and evaluation of the extent of the disease with high agreement


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