Optimisation des techniques de traitement des échantillons de cordon ombilical et immunophénotypage multiparamétrique des cellules souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton du cordon ombilical pour des applications en thérapie cellulaire

Optimization of umbilical cord processing techniques and multiparametric immunophenotyping of umbilical cord Wharton's jelly mesenchymal stem cells for cell therapy applications

• Auteur / Autrice : Olivier Degoul
• Direction : Colin McGuckin, Nico Forraz
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 30/09/2014
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : CTI Biotech
• Jury : Président / Présidente : Frédéric Mallein-Gérin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Colin McGuckin, Nico Forraz, Anne Mey
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christian Vacher, Florelle Gindraux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cordon ombilical

Thérapeutique cellulaire

Cellules stromales mésenchymateuses

Mots clés libres

Cordon ombilical

Cellules souches mésenchymateuses

Umbilical cord

Mesenchymal stem cells

Résumé

Avec environ 136,000,000 de naissances annuelles dans le monde, les cellules souches isolées à partir des tissus néonataux tels que le cordon ombilical présentent de nombreux avantages en terme d'accessibilité et de disponibilité. Le cordon ombilical contient un tissus de soutient présent en grande quantité et entourant les vaisseaux sanguin, la gelée de Wharton, qui a été démontrée dans plusieurs études comme très riche en cellules souches mésenchymateuses. Ces cellules souches multipotentes isolées à partir du cordon ombilical ont montré des capacité d'auto renouvellement et de différentiation en une variété de type cellulaire ayant un potentiel pour des applications en therapie cellulaire, pas uniquement en tant que cellules différenciés mais également grâce à d'importantes capacités immunomodulatrices et régulatrices de l'inflammation. Ce travail présente le développement de méthodes et d'outils permettant un traitement optimisé des échantillons de cordon ombilical et l'isolation d'explants de tissus de gelée de Wharton standardisés. Nous avons également étudié plusieurs méthodes améliorant l'isolation de MSC à partir de ces explants de tissus et développé un protocole de culture in‐vitro ne nécessitant pas l'ajout de sérum de veaux foetal ou la présence d'autres produits animaux dérivés dans le but de faciliter de futures applications cliniques. Nous avons développé un protocole de cytométrie en flux multiparamétrique dédié à l'analyse de l'expression de 27 antigènes et marqueur de surface présent sur les MSC de la gelée de Wharton et à l'étude des effets de diverses condition et événement durant la culture in‐vitro sur leur phénotype de surface. Le même protocole multiparamétrique a également été utilisé afin de comparer l'expression d'antigènes de surface des MSC isolés à partir de la gelée de Wharton et de la moelle osseuse, ou à des fibroblastes. Enfin, un protocole de différenciation ostéogénique a été appliqué avec succès aux MSC issues de la gelée de Wharton agrégées sur des granules d'hydroxyapatite fournissant ainsi un matériel autologue viable pour la réparation de manque osseux et spécialement développé pour la réparation de fente labio‐palatines

With around 136,000,000 births per year worldwide stem cells isolated from neonatal tissues such as the umbilical cord have many advantages in term of access and availability. The umbilical cord contains a connective tissue present in large quantities surrounding the blood vessels, the Wharton’s jelly, demonstrated as a very rich source of Mesenchymal Stem Cells (MSCs). Those multipotent stem cells isolated from the umbilical cord have shown self‐renewal and differentiation capability into a range of cells inherent potential for cell therapy applications not only as differentiated cells but also thanks to potent capabilities for immunomodulation and regulation of inflammation. In this work we designed process and tools allowing efficient use of umbilical cord samples and the isolation of standardized Wharton's Jelly tissue explants. We studied techniques improving MSC isolation from tissue explants and developed an in‐vitro culture protocol, free of Foetal Bovine Serum (FBS) and other animal sourced products and thus more likely to be used in clinical settings. We developed a multiparametric flow cytometry protocol dedicated to phenotyping the surface expression of 27 different antigens present on Wharton's Jelly MSCs and to study the effect of several in‐vitro culture conditions and events on their surface phenotype. The multiparametric protocol was used to compare surface expression of MSCs isolated from Wharton's jelly, bone marrow and skin harvested fibroblasts. Finally, clinical development of human WJ‐MSC in a bone tissue differentiation protocol was evaluated for cleft palate repair, demonstrating the useful application of this tissue source