Etude de la dynamique conformationnelle de FhaC, le transporteur membranaire de l'hémagglutinine filamenteuse de Bordetella pertussis

par Jérémy Guérin

Thèse de doctorat en Biochimie et biologie moléculaire

Sous la direction de Françoise Jacob-Dubuisson et de Hervé Vezin.

Soutenue le 30-09-2014

à Lille 2 , dans le cadre de École doctorale Biologie-Santé (Lille) , en partenariat avec Centre d'infection et d'immunité de Lille (laboratoire) .

Le jury était composé de Françoise Jacob-Dubuisson, Hervé Vezin.


  • Résumé

    La voie de sécrétion bactérienne de type V permet l’exportation à la surface cellulaire de protéines dont certaines ont été identifiées comme d’importants facteurs de la pathogénicité bactérienne. Le type V regroupe la sécrétion des autotransporteurs et la sécrétion à deux partenaires (TPS). Les autotransporteurs sont constitués d’un domaine en tonneau β; et d’un domaine passager. L’interaction de l’autotransporteur avec le complexe protéique Bam, dont la pièce centrale est le transporteur BamA, permet l’insertion dans la membrane externe du tonneau β; et la sécrétion du passager. En revanche, la sécrétion à deux partenaires fait intervenir deux protéines, l’une appelée TpsA correspondant à la protéine exportée et l’autre, TpsB, formant un tonneau β qui contrôle le transport à travers la membrane externe. Les protéines TpsB sont spécifiques à leur(s) TpsA associée(s), et font partie de la superfamille des transporteurs Omp85 qui effectuent l’insertion de protéines dans la membrane externe bactérienne comme BamA, et dans celles des organites eucaryotes dont les chloroplastes et les mitochondries. Au cours de mon doctorat, je me suis intéressé à la sécrétion de l’hémagglutinine filamenteuse (FHA), qui est l’adhésine majoritaire de Bordetella pertussis, l’agent étiologique de la coqueluche. Cette adhésine qui permet à la bactérie de coloniser le tractus respiratoire de l’hôte est une protéine TpsA de 220 kD. Elle est très efficacement sécrétée par la voie de sécrétion à deux partenaires grâce à son transporteur spécifique TpsB nommé FhaC. L’étude cristallographique de FhaC a révélé un tonneau β; à 16 brins qui forme un canal dans la membrane externe obstrué par l’hélice-α; amino-terminale, H1, partagée par la majorité des TpsB, et par une boucle de surface, L6, conservée dans la superfamille Omp85. Cette conformation suggère un état au repos dans lequel le canal bouché ne pourrait pas transporter son partenaire. Afin de comprendre comment la FHA transite à l’intérieur du pore, il est donc nécessaire de connaître les changements de conformations que subit FhaC. Durant mon travail de thèse, nous avons apporté une vision plus dynamique de la sécrétion à deux partenaires en utilisant le couple FHA/FhaC comme modèle d’étude. Pour cela nous avons utilisé principalement la Résonance Paramagnétique Electronique (RPE). Cette technique de biophysique permet d’étudier FhaC en solution ou réincorporée dans une bicouche lipidique et de rendre compte de la mobilité à un site donné par l’utilisation de sondes paramagnétiques. Ainsi nous avons pu montrer que FhaC est en équilibre entre plusieurs conformations, avec H1 dans le pore ou du côté périplasmique de FhaC. La présence de la FHA déplace cet équilibre, favorisant ainsi la sortie de l’hélice hors du pore. Nous avons, par ailleurs, pu démontrer expérimentalement que la FHA transitait bien à l’intérieur du pore formé par FhaC et que l’hélice H1 se trouvait alors dans le périplasme. L’étude de la boucle L6 nous a permis de montrer que la mobilité de cette boucle était fortement contrainte à l’intérieur du pore même lors de la reconnaissance avec la FHA. Ce ralentissement de mobilité est lié, en autre, à une interaction avec un résidu d’un motif conservé présent sur le brin β13 qui influence la taille du pore. De manière plus générale, cette étude de la dynamique de FhaC contribue à la compréhension des mécanismes moléculaires de la voie TPS et des transporteurs de la superfamille Omp85.

  • Titre traduit

    Conformational dynamics of FhaC, the TpsB transporter of filamentous hemagglutinin of Bordetella pertussis


  • Résumé

    Type V secretion in bacteria mediates the export to the cell surface of proteins, some of which have been identified as important factors of pathogenicity. Type V includes the secretion of autotransporters and the ‘Two-partner Secretion’ (TPS) pathway. Autotransporters consist of a β barrel domain and a passenger domain. The interaction of autotransporters with the Bam complex, of which the BamA transporter is the central component, allows the insertion of the β; barrel in the outer membrane and the secretion of passenger domain. In contrast, the two-partner secretion involves two proteins, the exported ‘TpsA’ protein and its TpsB partner that controls its transport across the outer membrane. TpsB proteins are specific to their associated TpsA(s) and belong to the superfamily of the Omp85 transporters, which carry out the insertion of proteins into the bacterial outer membrane, like BamA, or in the outer membranes of eukaryotic organelles including chloroplasts and mitochondria. For my PhD work, I have been interested in the secretion of filamentous hemagglutinin (FHA), which is the major adhesin of Bordetella pertussis, the causative agent of whooping cough. This adhesin allows the colonization by this bacterium of its host’s respiratory tract. This protein corresponds to a 220kD TpsA protein efficiently secreted by its specific transporter TpsB named FhaC. Crystallographic studies have revealed that FhaC harbours a 16-stranded β;-barrel occluded by both the N-terminal α;-helix, H1, shared by the majority of TpsB proteins, and by a surface loop, L6, that carries a conserved, hallmark motif of the Omp85 superfamilly. This conformation suggests that FhaC is in a resting state in which the channel does not transport its partner. To understand how the FHA passes through the FhaC pore, it is necessary to address the conformational changes undergone by FhaC. During my thesis work, we provided a more dynamic view of the TPS pathway using the FHA/FhaC couple as study model. For this we used Electron Paramagnetic Resonance (EPR). This biophysical technique allows to study of FhaC in solution or reincorporated into a lipid bilayer and it reports the mobility at specific sites of the protein by using paramagnetic probes. Thus we have shown that FhaC is in equilibrium between multiple conformations, with H1 in the pore or at the periplasmic side of FhaC. The presence of FHA displaces the conformational equilibrium, promoting the exit of the helix going from the pore. We have also experimentally demonstrated that FHA does transit through the pore formed by FhaC while helix H1 is then in the periplasm. The study of the L6 loop enabled us to show that the mobility of this loop is highly constrained in the pore and remains so upon the recognition of FHA. Its slow mobility is linked to an interaction between an invariant L6 residue and a conserved motif present on the β; strand 13 of the barrel. This interaction affects the size of the FhaC pore.More generally, the study of the dynamics of FhaC contributes to the understanding the molecular mechanisms of the TPS pathway and of transporters of the Omp85 superfamily.


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Informations

  • Détails : 1 vol. (115 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 109-115

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