Common and specific functions of paxillin and hic-5 in invadosome formation and activity

par Christos Petropoulos

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire

Sous la direction de Marc Block et de Olivier Destaing.

Soutenue le 31-01-2014

à Grenoble , dans le cadre de École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble) , en partenariat avec Institut Albert Bonniot (Grenoble) (équipe de recherche) .

Le président du jury était Rémy Sadoul.

Le jury était composé de Danijela Vignjevic.

Les rapporteurs étaient Stefan Linder, Frédéric Saltel.

  • Titre traduit

    Fonctions communes et spécifiques des protéines paxilline et hic-5 dans la formation et l'activité des invadosomes


  • Résumé

    L'invasion cellulaire est un processus basé sur la dynamique des invadosomes, qui sont desstructures acto-adhesives capables de dégrader localement la matrice extracellulaire. Lesinvadosomes sont composés d'un coeur riche en actine-F entouré par un assemblage desprotéines d'adhésion conduisant à la dégradation de la matrice extracellulaire par lerecrutement et la sécrétion des protéases. Les cellules MEF exprimantes la formeconstitutivement active de la kinase Src (SrcY527F) forment des invadosomes quis'organisent sous forme d'anneaux ou rosettes. Paxilline et hic-5 (une protéine homologue àla paxilline) ont des rôles spécifiques dans la morphologie cellulaire et la plasticité pendantl'invasion cellulaire. La structure de ces deux protéines se caractérise par la présence dedomaines LIM dans la partie C-terminale et de motifs LD dans la partie N-terminale. Cettesimilarité suggère que ces protéines peuvent avoir des fonctions redondantes. L'importance dela famille des protéines paxillines dans la formation des invadosomes a été examiné en tentantd'induire des invadosomes via l'expression de la forme constitutivement active de la kinaseSrc (SrcY527F) dans des cellules déplétées en paxilline et hic-5 (cellules pax-/- et déplétées enhic-5 par shRNA). La formation des invadosomes a été totalement bloquéequand l'expression de ces deux protéines a été diminuée de manière significativesimultanément indiquant leur redondance fonctionnelle. La ré-expression de nombreuxmutants de la paxilline dans ce contexte cellulaire a permis de montrer que les domaines LIMde paxilline n'étaient pas nécessaires pour la formation de l'anneau des invadosomes. Aucontraire, ces études de structure-fonctions ont permis de mettre en évidence le rôle essentieldes motifs LD3 et LD5 considérablement dans l'assemblage des rosettes. En outre, l'ordreprécis de chaque LD dans la molécule de paxilline est essentiel pour leur travail coopératifdans la régulation des invadosomes. Après avoir montré la redondance fonctionnelle entrepaxillin et hic-5, nous avons voulu déterminer leurs fonctions spécifiques. Pour cela,différents traitements siRNAs nous ont permis de diminuer spécifiquement l'expression depaxillin et/ou hic-5 dans des cellules formant des invadosomes. La déplétion rapide de lapaxilline a réduit la formation des rosettes alors que celle de hic-5 a affecté de manièreimportante la dégradation de la matrice extracellulaire. En effet, l'identification despartenaires spécifiques de paxilline et hic-5 à révélé que cette dernière interagissaitspécifiquement avec IQGAP1. Cette protéine est un facteur essentiel pour le recrutement del'exocyst, un complexe régulant la sécrétion locale de métalloprotéases dans lesinvadosomes. En conclusion, il apparaît que l'action complémentaire de la paxilline et hic-5 aun rôle essentiel dans la régulation des fonctions cellulaires assurées par les invadosomes.


  • Résumé

    Cellular invasion is based on invadosome dynamics where acto-adhesive machinery iscoupled with extracellular matrix proteolysis. Each invadosome unit is composed by a denseF-actin core surrounded by a ring of adhesion molecules that localizes intense ECMdegradation activity via the recruitment and secretion of lytic enzymes. Invadosomes in MEFstransformed with an activated form of the Src kinase (SrcY527F) auto-assemble into circularmeta-structures called rings or rosettes. Paxillin and the closely related family member hic-5(hydrogen peroxide inducible clone 5) have been recently identified as critical determinants ofcell morphology and plasticity during cell invasion with distinct signaling functions.However, the two proteins have a similar overall domain structure, including amino-terminalLD motifs and carboxyl-terminal LIM domains suggesting overlapping or redundantfunctions. We examined the importance of this class of proteins in invadosome formation, byexpressing SrcY527F in pax-/- cells depleted or not of hic-5. Only when the expression of bothproteins was significantly decreased, invadosome formation was blocked indicating theirfunctional redundancy. Importantly, LIM domain of paxillin was dispensable for ringformation whereas individual depletion of LD3 and LD5 motifs dramatically reducedinvadosome rosette assembly. Furthermore, the precise order of each LD in the paxillin'smolecule was necessary to allow their cooperativity during invadosome formation. Beyondtheir redundancy, their distinct roles in invadosomes were assessed via siRNA strategy aimingat the acute depletion of each molecule. Rapid depletion of paxillin reduced invadosome ringformation whereas hic-5 silencing dramatically affected extracellular matrix degradation. Hic-5 role in ECM degradation was enhanced by the fact that it was found to specifically interactwith IQGAP1, a CDC42- effector that is essential to recruit the exocyst complex ininvadosomes. In summary, the functional redundancy of paxillin and hic-5 suggests anextensive cross-talk between these two closely related proteins in the regulation ofinvadosome-based cellular functions.

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