Réactivité de la nitrate réductase périplasmique étudiée par spectroscopie RPE et électrochimie directe

par Julien Jacques

Thèse de doctorat en Sciences chimiques

Sous la direction de Bruno Guigliarelli et de Bénédicte Burlat.

Soutenue le 11-04-2014

à Aix-Marseille , dans le cadre de Ecole Doctorale Sciences Chimiques (Marseille) .

Le président du jury était Marius Réglier.

Le jury était composé de Jérôme Santolini.

Les rapporteurs étaient Benoît Limoges, Serge Gambarelli.


  • Résumé

    La nitrate réductase périplasmique de Rhodobacter sphaeroides catalyse la réduction du nitrate en nitrite. C'est une métalloenzyme qui comprend un cofacteur à molybdène, un centre fer - soufre et deux hèmes.La réactivité du cofacteur à molybdène reste mal comprise pour plusieurs raisons. Entre autres : l'hétérogénéité des signatures RPE Mo(V), état semi-réduit du site actif, et l'existence d'états inactifs de l'enzyme selon les conditions.Pour comprendre la réactivité et la pertinence catalytique des principales espèces Mo(V), nous avons entrepris une caractérisation des processus d'activation et d'inactivation par électrochimie sur film de protéines, et une étude de leur structure par spectroscopies RPE et HYSCORE.Nos observations cinétiques suggèrent que l'activation irréversible de l'enzyme implique un réarrangement d'une des ptérines du cofacteur à Mo.Ceci est mis en évidence par la modification des couplages magnétiques intercentres du fait de l'activation, et par des modifications de structure au delà de la première sphère de coordination du Mo.Enfin, l'étude de l'inactivation réversible de l'enzyme par électrochimie montre l'implication des différents états redox du site actif dans le mécanisme d'inhibition, et donne les conditions nécessaires au piégeage de formes Mo(V) actives.

  • Titre traduit

    Reactivity of periplasmic nitrate reductase studied by EPR spectroscopy and direct electrochemistry


  • Résumé

    Rhodobacter sphaeroides periplasmic nitrate reductase catalyses the reduction of nitrate into nitrite. It is a metalloenzyme containing a molybdenum cofactor, an iron - sulfur cluster, and two haems.The reactivity of the molybdenum cofactor remains elusive for many reasons. Among others : the heterogeneity of the EPR signatures of Mo(V), the semi-reduced state of the active site, and the existence of inactive states of the enzyme, depending on conditions.In order to understand the reactivity and the catalytic relevance of the major Mo(V) species, we have undertaken a characterisation of the activation and inactivation processes by protein-film-electrochemistry, and a study of their structure by EPR and HYSCORE spectroscopies.Our kinetic observations suggest that the irreversible activation of the enzyme involves a rearrangement of one of the pterins of the Mo cofactor.This is evidenced by the modification of intercentre magnetic couplings due to the activation, and by structural modifications beyond the first coordination sphere of Mo.Finally, the study of enzyme reversible inactivation by electrochemistry shows the involvement of the different redox states of the active site in the inhibition mechanism, and yields the necessary conditions to trapping active Mo(V) forms.


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