Analyse de la diversité structurale des complexes de protéasome humain par approches protéomiques quantitatives

par Bertrand Fabre

Thèse de doctorat en Biochimie et biotechnologies

Sous la direction de Marie-Pierre Bousquet et de Odile Schiltz.

Soutenue en 2013

à Toulouse 3 .


  • Résumé

    La plupart des fonctions cellulaires essentielles nécessitent l'action coordonnée d'un nombre important de protéines qui sont associées en complexes multi-protéiques, ces derniers étant souvent hautement dynamiques à la fois dans le temps, dans l'espace, et en abondance. Le protéasome, complexe multiprotéique ubiquitaire et présent dans tous les compartiments cellulaires, est indispensable à la survie des cellules eucaryotes car il est responsable de la dégradation de protéines modifiées et non fonctionnelles, ou de protéines impliquées dans la régulation de nombreux processus cellulaires clés. Le protéasome présente donc une grande diversité fonctionnelle, mais également structurale. Il est en effet constitué par l'association dynamique de plusieurs sous complexes, un cœur catalytique appelé protéasome 20S présent dans tous les complexes de protéasome, et quatre types de régulateurs, 19S, PA28a/ß, PA28?, et PA200. Le protéasome 20S existe lui-même sous 4 formes principales, selon l'intégration contrôlée des sous-unités catalytiques standards (ß1, ß2 et ß5), ou immunologiques (ß1i, ß2i et ß5i), et peut être présent sous forme libre dans la cellule ou en association avec un ou deux complexes régulateurs, identiques ou différents. Le niveau de connaissance de la stœchiométrie de ces complexes, de leur répartition cellulaire, de leur dynamique, et de leur rôle fonctionnel spécifique est aujourd'hui très limité. L'objectif de ce travail de thèse a été de développer des approches utilisant les techniques les plus récentes d'analyses protéomiques quantitatives basées sur la spectrométrie de masse pour étudier la diversité structurale des complexes de protéasomes. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la répartition des complexes de protéasome dans des cellules de leucémie aigüe myéloïde (U937 et KG1a). Pour cela, nous avons optimisé un protocole de fractionnement subcellulaire de cellule réticulées au formaldéhyde, un agent chimique qui va permettre de stabiliser les interactions protéine-protéine, associé à une technique de purification de l'ensemble des complexes de protéasome endogène et à une analyse par protéomique quantitative. Nos résultats ont montré qu'au niveau subcellulaire, le protéasome est régulé via des changements d'interaction avec ses régulateurs plutôt que via des variations de la stœchiométrie en sous unités-catalytiques. Dans un second temps, nous avons cherché à déterminer l'ensemble des protéines partenaires du protéasome dans les différents compartiments des cellules U937, pour accéder à ses fonctions subcellulaires principales. Nous avons montré que le protéasome est plutôt impliqué dans les voies de signalisation intracellulaire dans le cytosol alors qu'il est plutôt associé au contrôle qualité des protéines dans le réticulum endoplasmique. Dans le noyau, le protéasome semble avoir un rôle dans la transcription et la réparation de l'ADN endommagé. Ces résultats mettent en lumière des fonctions spécialisées du protéasome dans chaque compartiment cellulaire. Dans une troisième partie, nous avons étendu l'étude des complexes de protéasome à 8 lignées cellulaires d'origines différentes et avons pu montrer que les compositions en sous-unités catalytiques et en régulateurs étaient très variables en fonction du type cellulaire. Nous avons également développé une méthode d'étude de profil d'abondance protéique qui nous a permis de mettre en évidence des associations spécifiques et tout à fait originales de certains sous-complexes de protéasome, avec des régulateurs particuliers. L'une d'entre elles, l'interaction préférentielle entre l'immunoprotéasome et le régulateur PA28aß a pu être confirmée par d'autres approches biochimiques. Nos travaux, basés sur le développement d'outils biochimiques et de stratégies de protéomique quantitative innovants, ont donc permis de mieux comprendre la diversité, la stœchiométrie, et la dynamique des complexes de protéasome. Les méthodes développées pourront être appliquées à l'étude d'autres complexes protéiques d'intérêt.

  • Titre traduit

    Analysis of the diversity of proteasome complexes by proteomics approaches


  • Résumé

    Most of essential cellular pathways require the coordinated action of a large number of proteins that associate to form multi-protein complexes, often highly dynamic in time, space and abundance. The proteasome, an ubiquitous multiprotein complex, is responsible for the degradation of modified and non-functional proteins, or proteins involved in the regulation of most cellular key processes. Therefore the proteasome has a large functional, but also structural, diversity. It is constituted by the dynamic association between several complexes with a central catalytic particle, called 20S proteasome, present in all proteasome complexes, and four types of regulators, called 19S, PA28aß, PA28? and PA200. The cellular 20S proteasome exists in four main conformations, depending on the controlled integration of standard (ß1, ß2 and ß5), or immunological (ß1i, ß2i and ß5i) catalytic subunits, and can be found in its free form or in association with one or two, identical or different, regulatory complexes. The level of knowledge of these complexes stoichiometry, their cellular distribution, their dynamics and their specific functional roles is now very limited. The aim of this thesis project was to develop approaches using the most recent quantitative proteomic techniques based on mass spectrometry to study the structural diversity of proteasome complex. First, we studied the distribution of proteasome complexes in acute myeloid leukemia cells (U937 and KG1a). We optimized an integrated strategy combining in vivo formaldehyde cross-linking for an early stabilization of proteasome complexes, cellular fractionation of cross-linked cells, immunopurification of proteasome complexes, and label-free mass spectrometry quantification of proteins. Our results showed that, at the subcellular level, the proteasome is mainly regulated through changes in the 20S proteasome interaction with its regulators rather than through changes in the composition of its catalytic subunits. In a second part, we identified all proteasome associated proteins in three different compartments of U937 cells to determine its main subcellular functions. We showed that the proteasome is rather associated with intracellular signaling pathways in the cytosol whereas it is mainly associated with proteins involved in protein quality control in the endoplasmic reticulum. In the nucleus, we found that the proteasome is associated with proteins involved in transcription or DNA damage response. These results highlight a specialized function of proteasome in each cellular compartment. In a third part, we extended the study of proteasome complexes to 8 cell lines of different origins and we showed that catalytic subunits and regulators compositions of proteasome complexes are highly variable depending on the cell type. In addition, we have developed a method of protein abundance profiling that allowed us to define the existence of proteasome complex subtypes formed by specific 20S proteasome species and regulatory complexes. One of these preferential interactions involving the immunoproteasome and the PA28aß regulator has been confirmed by other biochemical approaches. Our work, based on the development of innovative biochemical tools and quantitative proteomic strategies, have thus helped to better understand the diversity, the stoichiometry and the dynamics of proteasome complexes at the subcellular level and between different cell types. The developed methods might be useful to study the distribution and composition of other protein complexes.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (220 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 194-207

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  • Bibliothèque : Université Paul Sabatier. Bibliothèque universitaire de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2013 TOU3 0328
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