Régulation de l'activité de l'E3 ubiquitine ligase ASB2alpha, un régulateur des cellules hématopoïétiques

par Rim Zakaria

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire

Sous la direction de Pierre Lutz .

Soutenue en 2013

à Toulouse 3 .


  • Résumé

    Le système ubiquitine-protéasome est l'un des mécanismes majeurs de protéolyse contrôlée régulant de nombreux processus cellulaires chez les Eucaryotes. La spécificité de ce processus est apportée par les E3 ubiquitine ligases. Les E3 ubiquitine ligases de la famille RING servent de plateformes permettant la liaison de l'enzyme de conjugaison de l'ubiquitine et du substrat. Elles jouent ainsi un rôle majeur dans la polyubiquitylation de leur(s) protéine(s) cible(s). Par conséquent, la caractérisation des différentes E3 et de leurs substrats ainsi que l'élucidation des mécanismes régulant leur fonction est importante pour mieux comprendre leur rôle. Ces données contribueront aussi au développement de nouvelles thérapies à travers le ciblage du système d'ubiquitylation. Le gène ASB2, un gène cible de protéines oncogéniques caractéristiques de leucémies aiguës myéloïdes, code deux isoformes dont la protéine ASB2a, la sous-unité de spécificité d'un complexe E3 ubiquitine ligase de la famille RING impliqué dans la différenciation hématopoïétique. ASB2a possèdent 12 répétitions ankyrine et une boite SOCS impliquée dans l'activité E3 ubiquitine ligase. L'équipe a identifié la filamine A, une protéine de liaison de l'actine, comme le premier substrat d'ASB2a et montré que le domaine minimal d'ASB2a nécessaire pour induire la dégradation de la filamine A comprenait le domaine N-terminal, spécifique de l'isoforme ASB2a, et les dix premières répétitions ankyrine. Les objectifs de mon projet de thèse étaient d'identifier des modifications post-traductionnelles régulant l'activité d'ASB2a ainsi que les protéines qui en sont responsables. Par différentes approches de spectrométrie de masse, nous avons mis en évidence la phosphorylation de la sérine 323 qui est localisée dans une région de l'ankyrine 10 hautement conservée au cours de l'évolution. Alors que la substitution de la sérine 323 par une alanine n'affecte pas l'activité E3 ubiquitine ligase intrinsèque, elle abolit la capacité d'ASB2a à induire la dégradation de la filamine A. Par contre, le mutant phosphomimétique d'ASB2a portant la substitution de la sérine 323 par un acide aspartique induit efficacement la dégradation de la filamine A. J'ai de plus montré l'implication de la voie ERK dans la phosphorylation de la sérine 323 d'ASB2a puisque l'inhibition de l'activité de ERK1/2 réduit la dégradation de la filamine A induite par ASB2a. Nous avons d'autre part étudié, par modélisation moléculaire, l'impact de la phosphorylation de la sérine 323 d'ASB2a sur la structure de la protéine. Nous proposons ainsi que l'interaction entre ASB2a et la filamine A dépend de la redistribution de potentiels électrostatiques induite par le groupement phosphate porté par la sérine 323 ou par la mutation phosphomimétique. Ces travaux démontrent un nouveau mécanisme de régulation d'une E3 ubiquitine ligase de la famille RING par la phosphorylation de sa sous-unité de spécificité ASB2a. Ils permettent aussi de mieux comprendre comment l'activité d'ASB2a est régulée et contribuent ainsi à la compréhension des processus régulateurs des cellules hématopoïétiques

  • Titre traduit

    Regulation of the activity of the E3 ubiquitin ligase ASB2α, a regulator of hematopoietic cells


  • Abstract

    Ubiquitin-mediated degradation is one of the major pathways for controlled proteolysis in Eukaryotic cells. In this pathway, E3 ubiquitin ligases determine the specificity of the process. E3 ubiquitin ligases of the cullin-RING ligase family provide platforms for binding ubiquitin-conjugating enzyme and a specific substrate, thereby playing a major role in the polyubiquitylation of proteins. Therefore, characterization of E3 ubiquitin ligases and their respective substrates and understanding the signals that regulate ubiquitin ligation events should contribute to the development of new therapies through the targeting of the ubiquitin system. The ASB2 gene is a target of three major oncogenic proteins in acute myeloid leukemia cells. ASB2 encodes the ASB2a isoform, the specificity subunit of an E3 ubiquitin ligase complex involved in hematopoietic differentiation. ASB2a harbors 12 ankyrin repeats and a SOCS box involved in the E3 ubiquitin ligase activity. Our group demonstrated that ASB2a E3 ubiquitin ligase activity drives polyubiquitylation and subsequent proteasomal degradation of actin binding protein filamin A. Furthermore, our group showed that a short N-terminal region specific to ASB2a, together with ankyrin repeats 1 to 10, is necessary for the association of ASB2a with filamin A. The aims of my PhD thesis were to identify ASB2a post-translational modifications that regulate ASB2a activity as well as proteins involved in these modifications. Using different proteomic approaches, we showed that ASB2a is phosphorylated at serine 323 that is located within a region of ASB2a ankyrine 10 highly conserved during evolution. Mutation of ASB2a Ser-323 to Alanine had no effect on intrinsic E3 ubiquitin ligase activity of ASB2a but abolished the ability of ASB2a to induce degradation of filamin A. In contrast, the ASB2a Ser-323 to Aspartate phosphomimetic substitution induced acute degradation of filamin A. Moreover, I demonstrated that the ERK signaling pathway is involved in ASB2a serine 323 phosphorylation because inhibition of Erk1/2 activity reduced ASB2a-mediated filamin A degradation. We also studied by molecular modeling, the impact of serine 323 phosphorylation on ASB2a structure. Altogether, our results suggest that the interaction of ASB2a with filamin A depends on the electrostatic potential redistribution induced by either the Ser-323 phosphate group or the phosphomimetic mutation. This work demonstrates a new regulation mode of an E3 ubiquitine ligase of the RING family through the phosphorylation of its specificity subunit, ASB2a. This should have broad implications for our understanding of ASB2a mechanisms of action in hematopoiesis and for modulating its activity for therapeutic means

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Informations

  • Détails : 1 vol. (125 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 97-123

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  • Bibliothèque : Université Paul Sabatier. Bibliothèque universitaire de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2013 TOU3 0269
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