Développement de méthodes moléculaires pour la détection et l'interprétation de mutations : applications aux cancers du colon et aux prédispositions génétiques aux cancers du sein et de l'ovaire

par Daniela Di Giacomo

Thèse de doctorat en Santé

Sous la direction de Thierry Frébourg.

Soutenue en 2013

à Rouen en cotutelle avec G. d'Annunzio Chieti-Pescara .


  • Résumé

    The first part of this thesis work is focused on the sensitive detection of KRAS and BRAF mutations in primary tumors of patients affected by metastatic colon cancer. The first line treatment of these patients in the department of Oncology of the S. Salvatore hospital in L'Aquila is based on a triple chemotherapy combined with an anti-angiogenic treatment (anti-VGFR; Bebacizumab). In order to determine the KRAS and BRAF status of these tumors we used a protocol based on the SnaPshot method. In a series of 59 patients, 3I tumors (53%) were found wild-type and 28 (47%) had mutations in codons 12 or 13 of KRAS. No mutation was found in BRAF. We found no significant clinical difference, using this therapeutic protocol, between the KRAS wild-type group and the mutant group. However, the KRAS mutation c. 35G>A (Glyl2Asp), found in 15 patients (25%), was found significantly associated with a worse prognosis of overall survival. The second part of this thesis is centered on the interpretation of variants of unknown significance (VUS), found in families with genetic predisposition to breast and ovarian tumors. We focused our work on the effect of VUS on mRNA splicing, by using a functional splicing assay based on the transient transfection of splicing reporter minigenes. BRCA2 exon 7 was selected as a model of exonic regulation of splicing. We tested a total of 32 sequence variants or mutations in this exon and found that 11 increased at various levels the exclusion of this exon, whereas 22 were neutral or induced slight increases of inclusion. By using a minigene that detects splicing enhancer activity, we showed, for most of the 11 variants, an alteration of exonic splicing regulatory elements. Moreover, we used this large series of sequence changes with experimentally demonstrated effects on splicing to validate a method recently proposed by Ke et al. , 2011 (L. Chasin group) for the prediction of the effects of mutations on exonic splicing regulation.


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  • Résumé

    La prima parte di questo lavoro di tesi riguarda la ricerca sensibile di mutazioni nei geni KRAS e BRAF in tumori primari di pazienti affetti da cancro del colon metastatico. Il trattamento in prima linea di questi pazienti, seguiti nel reparto di Oncologia dell'Ospedale S. Salvatore di L'Aquila, è basato su una triplice chemioterapia combinata con un trattamento anti-angiogenico (anti-VGFR; Bevacizumab). Per il genotipaggio del DNA tumorale abbiamo utilizzato la metodica SNaPshot, seguendo il protocollo messo a punto a Rouen, nei laboratori di Genetica somatica dei tumori. Questa metodica, infatti, permette di rilevare mutazioni anche in campioni contenenti una bassa percentuale di cellule tumorali. Su una serie di 59 pazienti, 31 (53%) sono risultati wild-type e 28 (47%) mutati KRAS (codoni 12 e 13). In questa serie di pazienti non sono state rilevate mutazioni nel gene BRAF. Per quanto riguarda l'evoluzione clinica, nel corso del protocollo terapeutico utilizzato, non è stata trovata nessuna differenza significativa tra il gruppo KRAS wild-type e KRAS mutato. Tuttavia, per questi pazienti trattati con triplice chemioterapia più Bevacizumab, la mutazione c. 35G>A (Gly12Asp), sul gene KRAS, trovata in 15 pazienti (25%), è stata associata significativamente ad una prognosi sfavorevole di sopravvivenza globale. La seconda parte di questa tesi è incentrata sull'interpretazione di varianti di sequenza di significato sconosciuto (VUS), trovate in famiglie con predisposizione genetica al tumore del seno e dell'ovaio, con un interesse particolare sull'effetto che queste varianti di sequenza hanno sullo splicing dell'RNA messaggero. Questo lavoro è stato realizzato in gran parte nell'Unità INSERM U1079, della facoltà di Medicina e Farmacia dell'Università di Rouen, utilizzando sistematicamente un test funzionale di splicing basato sulla trasfezione transitoria di minigeni che portano il cambio di sequenza. In una prima fase, il test, che si avvale di routine dell'utilizzo del minigene pCAS-2 messo a punto nell'Unità INSERM U1079, è stato utilizzato per studiare delle serie importanti di VUS trovate nella rete dei laboratori di diagnostica molecolare francesi o nei laboratori di diagnostica molecolare di L'Aquila e di Roma. Il progetto è stato focalizzato successivamente su un esone particolare del gene BRCA2, l'esone 7, selezionato come modello di regolazione esonica di splicing. Il lavoro descritto in questa tesi si incentra su un totale di 32 varianti di sequenza di questo esone analizzate nel minigene pCAS-2, nonché una gran parte anche nel minigene pcDNA-Dup, sviluppato nei laboratori INSERM U1079, che permette di individuare le variazioni di attività "enhancer di splicing" associate con i cambi di sequenza. Queste 32 varianti sono state anche classificate in due gruppi, in base al loro effetto sulla regolazione esonica di splicing: 11 aumentano, con livelli differenti, l'esclusione dell'esone 7 di BRCA2; 22 non aumentano l'esclusione. Questa importante serie di varianti di sequenza con effetti accertati sulla regolazione dello splicing ci ha permesso di validare un nuovo metodo per prevedere mutazioni esoniche di splicing (Ke et al. , 2011). Gli autori di questo metodo hanno condotto un'analisi sperimentale high-throughput sugli effetti di tutti i possibili 4096 esameri, inseriti in esoni modello, in diverse posizioni e assegnando a ciascun esamero uno "score" di inclusione/esclusione dell'esone. Noi abbiamo utilizzato questi scores per sviluppare una strategia di predizione dell'effetto delle varianti di sequenza studiate sperimentalmente nell'esone 7 di BRCA2. E' da notare come le predizioni del nuovo metodo basato sugli scores di esameri definiti da Ke et al. , 2011, sono risultate perfettamente concordanti con i risultati ottenuti, fatta eccezione per due VUS situate nella stessa posizione nucleotidica, per le quali non è stato osservato l'effetto previsto sullo splicing. I contributi maggiori di questa sezione della tesi sono stati la cartografia dettagliata degli elementi di regolazione esonici di splicing nell'esone 7 di BRCA2 e la validazione di una metodica di predizione dell'effetto che varianti di sequenza hanno su questa regolazione. Abbiamo dimostrato che questa nuova metodica di predizione è più affidabile dei metodi precedenti e proponiamo che questa possa essere incorporata attraverso programmi informatici adeguati nell'analisi di routine delle numerose varianti di sequenza osservate nelle attività di sequenziamento di nuova generazione. Questo lavoro contribuisce all'interpretazione delle VUS trovate in geni predisponenti al cancro in quanto dimostra che le variazioni di sequenza dell'esone, spesso hanno un impatto sulla maturazione dell'RNA messaggero, non solo per le modificazioni dei siti di splicing, ma anche per l'alterazione degli elementi esonici di regolazione. Gli effetti di queste alterazioni sono molto spesso parziali, il che rende difficile definire la loro eventuale patogenicità. Si propone di rafforzare studi multicentrici in modo da poter combinare i dati provenienti da diverse fonti, tra cui la struttura familiare, la segregazione di VUS, i dati clinici e le caratteristiche del tumore per definire un consenso per l'interpretazione di questi difetti parziali splicing.

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  • Détails : 1 vol. (132 f.)
  • Annexes : Bibliogr. p.123-132

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