Développement de nouvelles méthodologies en Chromatographie de Partage Centrifuge (CPC) : Application à l’isolement et la purification des peptides pharmaceutiques

par Nassima Amarouche

Thèse de doctorat en Pharmacie - STS

Sous la direction de Jean-Hugues Renault.

Soutenue le 18-09-2013

à Reims , dans le cadre de Ecole doctorale Sciences, technologies, santé (Reims, Marne) , en partenariat avec (ICMR) Institut de Chimie Moléculaire de Reims (laboratoire) .

Le président du jury était Cécile Enguehard-Gueiffier.

Le jury était composé de Jean Hugues Renault.

Les rapporteurs étaient Luc Marchal.


  • Résumé

    Les travaux de cette thèse portent sur le développement de nouvelles méthodologies de purification des peptides pharmaceutiques par chromatographie de partage centrifuge (CPC) dans le but de l'introduction de cette technique comme outil de R&D mais surtout de production en milieu industriel. Le caractère original de ces travaux porte essentiellement sur l'introduction de nouveaux systèmes de solvants et la mise au point de nouveaux procédés de purification en mode CPC co-courant. Les différents aspects liés à l'industrialisation des différents procédés de purification ont également été étudiés.La première partie des travaux a consisté en l'étude de quelques nouveaux aspects de l'intérêt de l'application du mode co-courant en chromatographie de partage centrifuge. Une méthodologie originale de purification des peptides tensioactifs non ioniques en mode CPC co-courant a été mise au point. Cette méthodologie a permis de résoudre les problèmes de perturbations hydrodynamiques et de perte de phase stationnaire engendrés par le caractère tensioactif de ces molécules et a été appliquée avec succès à la purification d'une cyclosporine modifiée douée d'une activité anti-virale et faiblement soluble dans les solvants usuellement utilisés en CLHP. Une étude fondamentale de l'effet du peptide sur le comportement hydrodynamique des deux phases lors de la séparation et la visualisation des modèles d'écoulement au sein de la colonne CPC a permis la mise en évidence du role de la ciclosporine modifiée dans la perturbation de la composition des phases du système chromatographique. D'autres aspects de l'intérêt du mode co-courant en CPC ont été étudiés lors de cette étude, notamment l'amélioration de la robustesse et de la résolution de la séparation.La seconde partie des travaux a porté sur le développement de nouveaux systèmes biphasiques de solvants particulièrement adaptés à la purification des peptides hydrophobes non-ioniques, notamment les intermédiaires de synthèse protégés, qui sont très faiblement solubles dans la plupart des solvants communs utilisés en chromatographie. Deux gammes quaternaire et quinaire de systèmes biphasiques de solvants, ainsi qu'un système biphasique ternaire ont été introduits. L'originalité de ces systèmes porte sur l'usage de solvants verts à fort caractère solvatant tel que le Methyl-THF et le cyclopentyl methyl ether (CPME). Les systèmes développés ont été efficacement utilisés pour la purification en CPC d'une exénatide protégée de 39 acides aminés et d'un peptide protégé de 8 acides aminés intermédiaire de la synthèse de la bivalirudine. Ces systèmes devraient être utiles pour une utilisation générale en CPC pour la séparation des peptides synthétiques hydrophobes libres ou protégés.

  • Titre traduit

    Development of new methodologies in Centrifugal Partition Chromatography (CPC) : Application in the isolation and purification of pharmaceutical peptides


  • Résumé

    The work presented in this thesis deals with the development of new methodologies for the purification of pharmaceutical peptides by centrifugal partition chromatography (CPC) in order to introduce this technique as a tool for R & D but also in industrial production. The original character of this work relies on the introduction of new solvent systems and the development of new purification processes based on the co-current CPC mode. The different aspects of the process intensification and industrialization have also been studied.In the first part of the work, a study of some new aspects of the interest of the application of the stationary phase co-current mode in CPC is described. An original method for the purification of non-ionic tensioactive peptides in the co-current CPC mode was developed. This method has been successfully applied to the purification of a modified cyclosporine showing a therapeutic interest. This particular elution mode, taking advantage of the liquid nature of the stationary phase, appears to be an efficient solution to get round some hydrodynamic instabilities that sometimes appears during a purification intensification by CPC. A fundamental study of the effect of the peptide on the hydrodynamic behavior of the two phases in the separation and visualization of flow patterns within the CPC column allowed highlighting the role of the peptide in the disruption of phases composition of the chromatographic system. Other aspects of the interest of the co-current mode in CPC were investigated in this study, including the improvement of the efficiency and the resolution of the separation.The second part of the work focused on the development of new biphasic solvent systems particularly suitable for the purification of hydrophobic non-ionic peptides, including protected intermediates, which are very poorly soluble in the most common solvents used in chromatography. Two new scales of biphasic solvent systems showing a wide range of polarity and a ternary biphasic system were introduced to overcome solubility problems often encountered with synthetic hydrophobic protected peptides. The originality of these systems relies on the use of green solvents with high solvating character such as Methyl-THF and cyclopentyl methyl ether (CPME). The developed systems have been effectively used for the purification in CPC of a 39mer protected exenatide and and a 8mer protected peptide intermediate of bivalirudin synthesis.


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