Rôle de la chaperonne HSP 70 dans l'éythropoïèse inefficace des béta-thalassémies majeures

par Jean-Benoît Arlet

Thèse de doctorat en Cancérologie : Biologie, Médecine, Santé

Sous la direction de Olivier Hermine.

Soutenue le 01-07-2013

à Paris 11 , dans le cadre de Ecole doctorale Cancérologie : Biologie, Médecine, Santé (2000-2015 ; Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne) , en partenariat avec Cytokines, hématopoïèse et réponse immune (laboratoire) et de Cytokines, hématopoïèse et réponse immune (laboratoire) .

Le président du jury était William Vainchenker.

Le jury était composé de William Vainchenker, Jeanne Amiel, Stany Chretien, Bruno Varet, Geneviève Courtois, Yves Beuzard.

Les rapporteurs étaient Jeanne Amiel, Stany Chretien.


  • Résumé

    L’érythropoïèse inefficace joue un rôle central dans la physiopathologie de l’anémie des β-TM. Ses caractéristiques sont triple: accélération de la différenciation érythroïde, arrêt de maturation au stade d’érythroblaste polychromatophile et mort par apoptose à ce stade de différenciation. Les mécanismes précis de cette apoptose et de l’arrêt de la maturation n’ont pas encore été élucidés. Il a été montré, au cours de l’érythropoïèse physiologique, que la protéine chaperonne Hsp70, en se localisant dans le noyau des érythroblastes en cours de différenciation, protège GATA-1 (facteur de transcription érythroïde majeur) de sa destruction par la caspase-3. Cette enzyme clé de l’apoptose est en effet activée physiologiquement au cours de la différenciation érythroïde et peut cliver GATA-1. Notre travail se base sur l’hypothèse suivante : Hsp70 pourrait, au cours de l’érythropoïèse des β-TM, être séquestrée dans le cytoplasme des érythroblastes matures (stade d’une intense hémoglobinisation) afin d’exercer son rôle de chaperonne des chaînes d’α-globine libres. Cela aurait comme conséquence néfaste l’absence de localisation nucléaire d’Hsp70 et, en conséquence, la destruction de GATA-1 à l’origine de l’arrêt de maturation et de la mort cellulaire. Nous avons montré dans ce travail qu’Hsp70 était localisée principalement dans le cytoplasme des érythroblastes matures dans la moelle de patients β-TM, avec un défaut d’expression nucléaire. Par ailleurs, GATA-1 n’est plus exprimé dans ces cellules. Nous avons confirmé ces résultats dans un système de culture cellulaire érythroïde humaine en milieu liquide reproduisant les étapes de la différenciation érythroïde terminale. Une intéraction physique directe entre Hsp70 et l’α-globine a été identifiée par techniques de microscopie confocale, d’immunoprécipitation et de double hybride. Enfin, la transduction dans les érythroblastes de β-TM d’un mutant d’Hsp70-S400A, principalement nucléaire, ou d’un mutant de GATA-1 non clivable par la caspase-3 corrige l’érythropoïèse inefficace.Une modélisation mathématique du complexe Hsp70/α-globine nous a permis de préciser les domaines impliqués dans l’intéraction, ce qui ouvre la voie à une possibilité de criblage de petites molécules permettant la rupture de ce complexe afin de ramener Hsp70 dans le noyau avec un espoir thérapeutique pour améliorer l’érythropoïèse inefficace des β-TM.

  • Titre traduit

    Role of the chaperone Hsp70 in beta-thalassemia major (β-TM) ineffective erythropoiesis


  • Résumé

    Β-TM is an inherited hemoglobinopathy caused by a quantitative defect in the synthesis of the β-globin chains of hemoglobin, leading to the accumulation of free α-globin chains that form toxic aggregates. Despite extensive knowledge on the molecular defects causing β-TM, little is known about the mechanisms responsible for ineffective erythropoiesis (IE), which is characterised by accelerated erythroid differentiation, maturation arrest and apoptosis at the polychromatophilic stage. We have previously demonstrated that normal human erythroid cell maturation requires a transient activation of caspase-3. Although GATA-1, the master transcriptional factor of erythropoiesis, is a caspase-3 target, we have shown that during human erythroid differentiation, it is protected from cleavage through its association with the chaperone Hsp70 in the nucleus. Hsp70 is constitutively highly expressed in normal human erythroid cells. The best-known role of this ubiquitous chaperone is to participate in proteins folding and refolding of proteins denatured by cytoplasmic stress, thus preventing their aggregation.In this study, we have evidenced that during the maturation of human β-TM erythroblasts, Hsp70 is sequestrated in the cytoplasm by the excess of free α-globin chains, resulting in nuclear GATA-1 cleavage and, in turn, end-stage maturation arrest and apoptosis. A molecular modeling shows that α-globin binds to a highly electronegative cavity formed by all Hsp70 domains. Additionally, the transduction of a nuclear-targeted Hsp70 mutant (Hsp70-S400A) or caspase-3 uncleavable GATA-1 mutant (µGATA-1) corrects β-TM ineffective erythropoiesis in human cultured β-TM cells. Our data indicate that cytosolic Hsp70 sequestration by α-globin chains prevents its nuclear localization and is a key mechanism of the β-TM IE. In order to increase nuclear Hsp70 translocation, developing small molecules that could increase Hsp70 expression or disrupt the Hsp70/α-globin complex could be a novel approach of targeted therapies to improve erythropoiesis in β-TM.


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