Functional analysis of the ADHD-susceptibility gene lphn3.1 in zebrafish

par Merlin Lange

Thèse de doctorat en Neurosciences

Sous la direction de Laure Bally-Cuif.

Le président du jury était Hervé Daniel.

Le jury était composé de Laure Bally-Cuif, Hervé Daniel, Pertti Panula, Bruno Giros, Sylvie Granon, Filippo Del Bene.

Les rapporteurs étaient Pertti Panula, Bruno Giros.

  • Titre traduit

    Analyse fonctionnelle du gène de susceptibilité au TDAH lphn3.1 chez le zébrafish


  • Résumé

    Le trouble du déficit de l’attention / hyperactivité (TDAH; MIM#143465) est une maladie neurocomportementale, induit par un trouble précoce au cours du développement et caractérisé par trois phénotypes cliniques : un déficit de d’attention, une hyperactivité et de l’impulsivité. En collaboration avec le Professeur Klaus-Peter Lesch (Université de Würzburg, Allemagne), nous avons eu comme objectif de valider l’implication du gène Latrophilin 3 (LPHN3) dans le TDAH. La prédisposition génétique LPHN3 pour le TDAH a été mis en évidence par des études d’association génétique menées sur des patients atteints de la maladie (Arcos-Burgos et al., 2010). La fonction endogène de LPHN3 sur le comportement n’avait, jusqu’à présent, jamais été étudiée. Nous avons injecté un morpholino dans des œufs de zebrafish (Danio rerio) pour réduire transitoirement l’expression de l’orthologue lphn3.1 chez le zebrafish. A 6 jours, les morphants lphn3.1 sont hyperactifs et ont également une impulsivité locomotrice, deux caractéristiques qui se retrouvent dans le comportement des patients atteints du TDAH. Par ailleurs, nous avons pu corréler ces défauts comportementaux avec des problèmes dans le développement et la neurotransmission des neurones dopaminergiques (DA). Le phénotype d’hyperactivité peut être restauré par le methylphenidate et l’atomoxetine, deux des principaux traitements du TDAH (Lange et al., 2012). Par conséquent une diminution de lphn3.1 au cours du développement précoce modifie la neurotransmission et le développement de la dopamine. Nous avons ensuite étudié plus précisément les voies de signalisation dopaminergiques affectées par la perte de fonction de Lphn3.1 et ce, par l’utilisation de tests pharmacologiques sur les morphants lphn3.1. L’analyse des effets de différents agonistes et antagonistes - sélectifs ou non sélectifs - de la DA sur la locomotion des larves Lphn3-MO1 met en évidence une diminution de la réponse au drogues dopaminergiques chez ces animaux. Ces résultats sont compatibles avec un modèle dans lequel les cerveaux des morphants lphn3.1 présenteraient une augmentation globale des niveaux de dopamine. En effet, des niveaux de dopamine élevés à la synapse activeraient les récepteurs dopaminergique de classe-D1 et de classe-D2 et déclencheraient l’hyperactivité, de plus la saturation de la transmission dopaminergique, modèrerait les effets des agonistes et des antagonistes. Ces résultats sont prometteurs, mais nécessitent des travaux supplémentaires pour confirmer notre hypothèse. En parallèle, nous avons mis en place des tests de comportement afin d’étudier l’ontogénie de la locomotion du zebrafish. Nous avons également développé un nouveau logiciel permettant de trier directement les données comportementales à partir des fichiers brutes. L’ensemble de ces avancées ouvre la voie à la réalisation de screens comportementaux sur la locomotion de zebrafish à différents stades. J’ai pu tirer profit de cette méthode en quantifiant le comportement moteur de six souches de zebrafish (à 6 jours, 1 mois et 3 mois). De façon générale, le zebrafish présente d’importantes variations pour tous les paramètres comportementaux mesurés (à la fois au cours du temps et entre souches), révélant que les facteurs environnementaux comme les facteurs génétiques altèrent la reproductibilité du comportement. Les résultats de cette thèse tendent donc à décrire l’implication de LPHN3 dans l’étiologie de l’ADHD mais aussi de manière plus concrète dans l’établissement de la signalisation DAergique au cours du développement. Ces travaux mettent également en évidence les avantages du zebrafish comme modèle animal pour des études génétiques et comportementales.


  • Résumé

    Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder (ADHD; MIM#143465) is a common, early onset and enduring neuropsychiatric disorder characterized by developmentally inappropriate inattention, hyperactivity, increased impulsivity and motivational dysregulation. In collaboration with Prof. Klaus-Peter Lesch, psychiatrist at the University of Würzburg (Germany), we aimed to validate the ADHD susceptibility gene Latrophilin 3 (Lphn3) in disease formation. LPHN3 had been linked with ADHD in genetic association studies on ADHD patients, followed by fine locus mapping (Arcos-Burgos et al., 2010). The endogenous function of LPHN3, in particular its potential impact on behavior, had never been studied. I used morpholino injections to transiently reduce the expression of the zebrafish ortholog lphn3.1. Using behavioral assays, I demonstrated that lphn3.1 morphants display hyperactivity and motor impulsivity at 6 days post fertilization, two characteristics reminiscent of the behavior of ADHD patients. Moreover this abnormal behavior was correlated with a reduced number and misplacement of dopamine (DA) neurons in the ventral diencephalon. Finally, the hyperactivity phenotype could be rescued by the ADHD treatments drugs methylphenidate and atomoxetine (Lange et al., 2012). Because these results suggest that impairments in DA development and neurotransmission may be linked with Lphn3 misfunction and ADHD formation, I next aimed to dissect the DAergic pathways affected by loss of Lphn3 function, using the advantage of zebrafish larvae for pharmacological assays. My analysis of the effects of several non-selective and selective DA agonists and antagonists on the locomotion of lphn3.1 morphant larvae highlights a decreased response to DA drugs in these animals. This is compatible with a model where lphn3.1 morphants would harbor a global increase in DA levels. Indeed, high levels of DA at the synaptic cleft would activate D1-like and D2-like receptors triggering hyperactivity, and would saturates DA transmission, moderating the effects of agonists and antagonists. Although these results are promising, additional work will be required to confirm our hypothesis. In parallel, I also established robust assays to study zebrafish locomotion and novel software to directly sort behavior data. Together, these advances open the way to high-throughput behavioral screens of zebrafish locomotion at different stages. I took advantage of this method to quantify the locomotor ontogeny of six zebrafish strains throughout life (at 6 days, 1 month and 3 months). Overall, zebrafish displayed striking variations in all the behavioral parameters measured, both between strains and over time, highlighting that both environmental and genetic factors alter behavioral reproducibility. Together, the results of this thesis implicate LPHN3 in the etiology of ADHD and in establishing DA signaling during development. They also push forward the advantages of zebrafish for behavioral genetics studies.


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