Etude transcriptionnelle et fonctionnelle du groupe de gènes vanGCd de C. difficile

par Fariza Ammam

Thèse de doctorat en Microbiologie et thérapeutiques anti-infectieuses

Sous la direction de Thierry Lambert et de Thomas Candela.

Le président du jury était Anne Collignon.

Le jury était composé de Thierry Lambert, Thomas Candela, Anne Collignon, Michel Arthur, Bruno Périchon, Pascale Serror.

Les rapporteurs étaient Michel Arthur, Bruno Périchon.


  • Résumé

    C. difficile est une bactérie anaérobie du tube digestif reconnue comme l’agent responsable de 25% des diarrhées nosocomiales post antibiotiques et de la plupart des colites pseudomembraneuses. Le métronidazole et la vancomycine sont les traitements de référence pour les infections liées à ce pathogène. A ce jour, aucune souche de C. difficile résistante à la vancomycine n’a été rapportée. Paradoxalement, 85 % des souches de cette espèce hébergent dans leur génome un groupe de gènes cryptiques vanGCd homologue à l’opéron de résistance à la vancomycine vanG de E. faecalis. Dans ce travail, nous avons étudié la capacité des gènes vanGCd à conférer la résistance à la vancomycine. L’étude transcriptionnelle a révélé que le groupe de gènes vanGCd est transcrit en deux opérons (i) l’un de régulation exprimé de façon constitutive et (ii) l’autre de résistance, inductible par la vancomycine. L’analyse enzymatique de VanGCd, VanXYCd et VanTCd in vitro a montré que ces protéines possèdent respectivement des activités ligase, D,D-peptidase et racémase nécessaires au pontage D-Ala-D-Ser et à l’hydrolyse des dipeptides naturels D-Ala-D-Ala. L’analyse des précurseurs du peptidoglycane par spectrométrie de masse en présence de vancomycine a permis l’identification de l’UDP-MurNAc-pentapeptide [Ser] témoin de l’activité in vivo de ces protéines. L’opéron de résistance vanGcd cloné chez E. coli NR698 sensible à la vancomycine exerce un très faible effet sur la CMI de cet antibiotique. En revanche, le clonage chez E. faecalis n’a pas été obtenu en raison de mutations spontanées. Pour ces raisons, nous avons introduit l’opéron vanC de E. gallinarum chez C. difficile et observé une faible augmentation de la CMI de la vancomycine. Ce résultat indique que l’expression de la résistance à cet antibiotique chez C. difficile implique des facteurs intrinsèques liés à la bactérie. Nous avons observé que la ligase MurF possède une meilleure affinité vis-à-vis du dipeptide D-Ala-D-Ala que pour le dipeptide D-Ala-D-Ser ce qui pourrait impacter la synthèse de l’UDP-MurNAc-pentapeptide[Ser]. Par ailleurs, nous avons observé qu’en présence de vancomycine, les précurseurs du peptidoglycane sont amidés. Cette modification affecte également le peptidoglycane mature. Toutefois, le rôle physiologique de l’amidation chez C. difficile reste à élucider. En conclusion, (i) l’absence d’expression de la résistance à la vancomycine de C. difficile est multifactorielle, (ii) le groupe de gènes vanGCd a peu de potentiel pour contribuer à l’émergence de la résistance à la vancomycine.

  • Titre traduit

    transcriptional and functional analysis of vanGCd of C. difficile


  • Résumé

    Clostridium difficile is a major enteric pathogen responsible for 25% of post antibiotics diarrhea and most cases of pseudomembranous colitis. Metronidazole and vancomycin are the standard treatments for infected patients. vanGCd, a cryptic gene cluster highly homologous to the vanG gene cluster of Enterococcus faecalis is largely spread in Clostridium difficile. Since emergence of vancomycin resistance would have dramatic clinical consequences, we have evaluated the capacity of the vanGCd cluster to confer vancomycine resistance. We showed that expression of vanGCd is inducible by vancomycin and that VanGCd, VanXYCd and VanTCd are functional, exhibiting D-Ala:D-Ser ligase, D,D-dipeptidase and D-Ser racemase activities, respectively. In other bacteria, these enzymes are sufficient to promote vancomycin resistance. Trans-complementation of C. difficile with the vanC resistance operon of Enterococcus gallinarum faintly impacted the MIC of vancomycin, but did not promote vancomycin resistance in C. difficile. Sub-lethal concentration of vancomycin led to production of UDP-MurNAc-pentapeptide [D-Ser], suggesting that the vanGCd gene cluster is able to modify the peptidoglycan precursors. Our results indicated amidation of UDP-MurNAc-tetrapeptide, UDP-MurNAc-pentapeptide[D-Ala] and UDP-MurNAc-pentapeptide[D-Ser]. This modification is passed on the mature peptidoglycan where a muropeptide Tetra-Tetra is amidated on the meso-diaminopimelic acid. We also demostrated that the ligase MurF has a better affinity for the D-Ala-D-Ala dipeptide than for the D-Ala-D-Ser, which could impact on the synthesis of UDP-MurNAc-pentapeptide [Ser].In conclusion, the lack of vancomycin resistance expression may be due to several factors that, in combinination with a gene cluster conferring a low level vancomycin resistancemay prevent the emergence of vancomycin resistance based on D-Ala- D-Ser modification of peptidoglycane precursors in C. difficile.


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