L’homéostasie du cuivre chez la protéobactérie Rubrivivax gelatinosus

par Asma Azzouzi

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Chantal Astier et de Soufian Ouchane.


  • Résumé

    L’adaptabilité des cellules aux changements environnementaux repose sur leur capacité à mettre en place des complexes enzymatiques qui régulent leurs différentes voies métaboliques. Ces complexes protéiques nécessitent des cofacteurs (hème et métaux) comme le cuivre. En effet, le cuivre est un oligoélément essentiel pour la survie des organismes vivants, il est notamment présent dans des complexes tels que la cytochrome c oxydase de la chaine respiratoire aérobie. Cependant, l’excès de Cu est aussi néfaste pour la cellule. Il génère du stress oxydatif responsable de divers dommages cellulaires. Il est donc nécessaire aux cellules de contrôler la prise en charge du cuivre afin d’assurer la régulation de sa concentration intracellulaire. Dans ce travail, nous avons étudié le système de tolérance au cuivre chez Rubrivivax gelatinosus. J’ai identifié plusieurs gènes impliqués dans ce système, un de ces gènes code pour un transporteur de cuivre CopA (homologue aux ATP7A/ATP7B de l’homme). Les autres gènes codent pour : un régulateur de ce système sensible aux variations du cuivre CopR et deux protéines solubles (CopI et CopJ) fortement induites dans des conditions d’excès de cuivre. J’ai également montré que malgré l’homologie de séquence entre les pompes à cuivre CopA et CtpA (identifiées auparavant au laboratoire) ; elles remplissent deux rôles physiologiques différents dans la cellule. CopA est vitale pour la tolérance au Cu alors que CtpA a un rôle dans l’insertion du Cu au sein des cuproprotéines. Par ailleurs, j’ai montré qu’en absence de CopA, la toxicité du cuivre est plus importante dans les conditions de croissance en microaérobie ou en photosynthèse anaérobe. En effet, l’excès du Cu affecte la voie de biosynthèse des porphyrines (hèmes et bactériochlorophylles) reflété par l’accumulation d’un intermédiaire de cette voie, la coproporphyrine III. Cette accumulation résulte de l’effet de l’excès du cuivre sur la coproporphyrine III oxydase (HemN) probablement en déstabilisant son cluster [4Fe-4S]. Ces résultats sont soutenus par le fait que l’effet toxique du cuivre sur les tétrapyrolles n’est pas observé à forte aération en raison de la substitution de HemN par une enzyme à centre bimétalliques HemF. Cette dernière tolère et utilise l’oxygène, notre étude suggère qu’elle tolère aussi le cuivre. Les résultats obtenus sur les cibles du cuivre en anaérobie au cours de cette étude ainsi que celle publiés par Macomber (Macomber and Imlay 2009), suggèrent que les métaux ont pu éventuellement jouer un rôle dans l’émergence des enzymes à clusters bimétalliques lors du passage à une atmosphère oxygénique permettant une adaptation à l’augmentation de la toxicité de certains métaux. L’ensemble des résultats obtenus à partir de l’analyse des différents mutants au cours de cette étude sur la tolérance au cuivre chez R. gelatinosus me permet de proposer un modèle d’efflux du cuivre différent de celui d’E. coli. Je propose d’attribuer un rôle crucial aux protéines solubles CopI et CopJ qui fixeraient probablement le cuivre grâce aux nombreux résidus histidines et méthionines. Leurs rôles seraient soit de séquestrer le cuivre au niveau du périplasme, soit de l’oxyder ou encore de l’excréter vers un système d’efflux de la membrane externe afin de le chasser de la cellule.

  • Titre traduit

    Copper homeostasis in the beta-proteobacteria Rubrivivax gelatinosus


  • Résumé

    The ability of Rubrivivax to adapt to its environment (aerobic versus anaerobic) relay on its ability to assemble different complexes involved respiration or photosynthesis pathways. These complexes require cofactors such as heme or chlorophylls, and metals such as magnesium, iron and copper. In particular, copper (Cu) is an essential trace element required for the assembly and the activity of the cytochrome c oxidase in the aerobic respiratory chain. Excess Cu however, is toxic and can originate in various cellular damages. In the absence of a tight control of copper entrance in the cells, bacteria have evolved different efflux systems to control copper concentration within the cytoplasm and the membrane. Very few data are available on the copper homeostasis systems in photosynthetic bacteria. We therefore studied the copper homeostasis system in Rubrivivax gelatinosus to understand how these microorganisms can deal with excess copper. In this work, I have identified several genes involved in copper tolerance. Central to this system, the P1B-type Cu⁺-ATPase CopA plays a major role in copper tolerance and translocates copper from the cytoplasm to the periplasm. The outlet of copper in the periplasm varies depending on the species. Cu can be sequestrated, oxidized or released outside the cells. Here I describe the identification CopI, a periplasmic protein present in many proteobacteria including Pseudomonas and Cupriavidus and show its requirement for copper tolerance in Rubrivivax under both aerobic and anaerobic conditions. Expression of both CopA and CopI is induced under excess copper and is regulated by CopR, a MerR regulator sensitive to changes in copper concentration. Rubrivivax genome encodes two P1B-type Cu⁺-ATPases, CopA and CtpA. My work confirmed that despite the sequence homology between these copper ATPases, they fulifill two different physiological roles in the cell. CopA is vital for tolerance to Cu while CtpA has a role in the insertion of Cu within cuproproteines. Furthermore, I showed that excess copper in the copA⁻ null mutant resulted in a substantial decrease of the cytochrome c oxidase and the photosystem under microaerobic and anaerobic conditions together with the extrusion of coproporphyrin III. Analyses of the mutant indicated that copper targeted the tetrapyrrole biosynthesis pathway at the level of the coproporphyrinogen III oxidase HemN and thereby affects the heme and chlorophyll containing complexes, the oxidase and the photosystem. These results, as well as published work by Macomber (Macomber and Imlay 2009) suggest that Cu target the 4Fe-4S clusters and that this metal may have played a role in the emergence of bimetallic enzymes to replace 4Fe-4S clusters during the appearance of oxygen in the atmosphere.Analyses of CopI expression and the copI⁻ null mutant, demonstrate that CopI is required for copper tolerance, and in the absence of an E. coli Cus-like copper efflux system in R. gelatinosus, my results strongly suggest that CopI is the major copper handling protein within the membrane. Altogether, my results allowed me to draw a comprehensive picture of the copper tolerance system within the purple photosynthetic bacterium Rubrivivax gelatinosus and probably other proteobacteria that possess a homologue of copI gene.


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