Identification and validation of key factors of stress tolerance in Arabidopsis thaliana

par Agyemang Danquah

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Jean Colcombet et de Heribert Hirt.

Soutenue le 04-04-2013

à Paris 11 , dans le cadre de Ecole doctorale Sciences du Végétal (1992-2015 ; Orsay, Essonne) , en partenariat avec Unité de recherche en génomique végétale (Evry) (laboratoire) .

  • Titre traduit

    Identification et caractérisation de facteurs responsables de la tolérance au stress chez Arabidopsis thaliana


  • Résumé

    Les stress abiotiques sont la cause principale des pertes de rendement agricole dans le monde. Aujourd'hui, le développement d'espèces capables de résister à ces stress est d'une importance majeure, en particulier dans le contexte de la croissance démographique actuelle et du changement climatique mondial. La phytohormone acide abscissique (ABA) contrôle divers processus cellulaires et induit un signal de protection des plantes contre les stress abiotiques. Parmi les différents évènements moléculaires impliqués dans la voie de signalisation de l'ABA, les cascades de signalisation des mitogen activated protein kinase (MAPK) jouent un rôle important dans la transmission du signal. Cependant, seulement un nombre réduit de MAPK ont été identifiées et caractérisées jusqu'à maintenant.J'ai isolé 2 proches homologues MEKK-like MAPKKKs d'Arabidopsis, MAPKKK17 et MAPKKK18, dont le niveau d'expression étaient fortement induit en réponse à l'ABA et aux stress abiotiques. Chez les mutants insensibles à l'ABA, pyr1/pyl1/pyl2/pyl4 et hab1G246D, l'expression ABA- et sel-dépendant de ces deux gènes était fortement réduite, indiquant que ces 2 kinases agissent en aval du complexe de signalisation de l'ABA. L'utilisation de plantes transgéniques exprimant, sous le contrôle de son propre promoteur, le gène MAPKKK18 fusionné à une étiquette PC2 ou YFP a permis de montrer par western blot que la protéine s'accumulait suite à un traitement à l'ABA et non pas en réponse au stress abiotiques. Ces données montrent que l'ABA est le régulateur majeur de la fonction de MAPKKK18.Suite à une approche de yeast-2-hybrid, j'ai pu identifier MKK3 comme la seule MAPKK interagissant avec MAPKKK17 and MAPKKK18. Ces résultats ont pu être confirmés via la technique de BiFC. Dans des protoplastes de mésophylle, il apparait que MAPKKK17 et MAPKKK18 activent MKK3, indiquant que ces deux gènes codent pour des kinases fonctionnelles. Afin d'apporter des preuves génétiques, j'ai isolé les T-DNA knockout mutants de ces 3 gènes. Des analyses de germination révèlent que mkk3-1 est hypersensible à l'ABA, au sel et au mannitol tandis que la lignée de surexpression Gain-de-fonction présente un phénotype opposé. Cependant, les doubles mutants mapkkk17/18 ne présentent pas de phénotype de germination. D'autres analyses ont pu montrer que mkk3-1 est sensible à la sécheresse et au stress salin tandis que les lignées surexpresseures sont plus tolérantes. Le double mutant mapkkk17/18 est quant à lui seulement sensible au NaCl. Pris dans leur ensemble, ces résultats indiquent que MAPKKK17/MAPKKK18 et MKK3 forment un complexe régulant la réponse des plantes aux stress abiotiques selon une voie dépendantes de l'ABA.


  • Résumé

    Abiotic stresses are the principal cause of crop failure worldwide. Developing crop plants better able to withstand these stresses has assumed great importance especially in the context of current population growth and global climatic change. The phytohormone abscisic acid (ABA) regulates diverse cellular processes and transduces signals to protect plants from abiotic stresses. Among the molecular elements working in ABA signaling, the mitogen activated protein kinase (MAPK) cascades play important roles in regulating the signaling network. To date, however, only a handful of MAPKs have been identified and characterized in ABA signaling. I isolated 2 closely related Arabidopsis MEKK-like MAPKKKs, MAPKKK17 and MAPKKK18, whose transcript expressions were highly induced by ABA and abiotic stresses. In 2 ABA insensitive mutants, pyr1/pyl1/pyl2/pyl4 and hab1G246D, the ABA- and NaCl-dependent expression of MAPKKK17 and MAPKKK18 was strongly reduced, indicating that these 2 kinases act downstream of the core ABA signaling complex. Western blot analysis of transgenic plants that expressed either a PC2 or YFP tagged MAPKKK18 under endogenous promoter revealed that MAPKKK18 protein strongly accumulated in response to ABA treatment but not in response to other abiotic stresses. This data indicated that ABA is the major regulator of MAPKKK18 protein function.Using yeast-2-hybrid approach, I identified MKK3 as the downstream MAPKK interactor of MAPKKK17 and MAPKKK18, and confirmed these interactions via BiFC assays. In mesophyll protoplasts, MAPKKK17 and MAPKKK18 activated MKK3, indicating that these 2 genes encode functional kinases. To provide genetic evidence of their functions, I isolated T-DNA knockout mutants of these genes. Germination assays reveal that mkk3-1 mutant was hypersensitive to ABA, NaCl and Mannitol stress whereas the over-expression line was resistant. The double homozygous mutant of mapkkk17/18 was not affected in germination. Further analysis revealed that mkk3-1 seedlings were sensitive to NaCl and terminal drought whereas the over-expression lines were resistant. The mapkkk17/18 seedlings were susceptible to NaCl but not terminal drought. Taken together, these results suggest that MAPKKK17/MAPKKK18 and MKK3 form complexes to regulate plant responses to abiotic stress in an ABA-dependent manner.


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