Focal adhesions mechanosensitivity of human mesenchymal stem cells : a fluorescence spectroscopy-based approach of focal adhesion proteins dynamics and interactions in living cells

par Zengzhen Liu

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire

Sous la direction de Maïté Coppey-Moisan.

Soutenue en 2013

à Paris 7 .

  • Titre traduit

    Mécanosensibilité des adhésions focales en cellules souches mésenchymateuses humaines : une approche basée sur la spectroscopie de fluorescence pour l'analyse dynamique des protéines d'adhésion et de leurs interactions en cellules vivantes


  • Résumé

    Tissue rigidity or stiffness affects many biological processes in embryonic development and aduit physiology and are involved in numerous diseases. Rigidity sensing by cells and how cells respond to it, are thus crucial aspects in biology and medicine. Mesenchymal stem cells present unique properties as their fate is regulated by the stiffness of extra cellular matrix (ECM). Focal adhesions (FAs) are the mechanosensitive elements that connect the cell to its mechanical environment. Because insight emerges that the dynamic processes intrinsic to the FAs and cytoskeleton would be decisive in the transduction of mechanical stimuli into biochemical signais, we address the relationship between the diffusion and binding properties of FAs proteins and rigidity sensing in human mesenchymal stem cells (hMSC). We cultured primary hMSC derived from bone marrow, on collagen-coated polyacrylamide gels of defined and controlled stiffness. Nascent adhesions and/or adhesions at the leading edge assemble and disassemble or mature into bigger FAs to sustain higher contractile forces which take place at higher ECM rigidity. To determine whether the turnover and growth of FAs in hMSC depends on the stiffness of the ECM, and to decipher the role of the dynamics and interactions of signaling scaffolding proteins in these processes, we monitored the diffusion and binding properties of FAK, paxillin, talin and vinculin within hMCS cells. Our studies based on different fluorescence microscopy approaches as FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching), F(C)CS (Fluorescence (Cross) Correlation Spectroscopy) and FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) by FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), ail together revealed that that the residence time of these proteins within FA structures increases along with the substrate rigidity. This property is correlated with the dynamics and instability of the FA complex membership itself, as well as with the dynamical cell behavior, properties that are therefore regulated by the substrate rigidity. In addition, our data show the existence of intracellular multitiered molecular clutch at the FA scaffold, including several rigidity-dependent molecular bindings with different kinetics (meaning likely molecular linkage with different strength). Especially, we showed that monomers of talin and vinculin bind to the scaffold with several rigidity-dependent dissociation rates and interact between each other only when immobilized. The proportion of immobilized talin-vinculin interacting species (for wild type vinculin as well as constitutively active mutant) was weakly dependent on the ECM rigidity, emphasizing the role of proteins dynamics instead of proportion of immobilization in rigidity sensing mechanism. Interestingly, the stabilization of talin at the FA site by a constitutively active vinculin mutant is much stronger at weak rigidity than at high rigidity of ECM, revealing a high potency of signaling regulation at weak rigidity in this type of cells. Specifically, our study focused on the dynamics and organization of FAs, seen as mechanical sensors of ECM rigidity and thus likely suited to support the initial steps of rigidity-dependant hMSC differentiation processes.


  • Résumé

    Rigidité ou raideur des tissus affecte de nombreux processus biologiques dans le développement embryonnaire et la physiologie des adultes et sont impliqués dans de nombreuses maladies. Rigidité de détection par les cellules et comment les cellules répondent à elle , sont donc des aspects essentiels de la biologie et de la médecine. Cellules souches mésenchymateuses présentent des propriétés uniques que leur sort est régi par la rigidité de la matrice extra-cellulaire (ECM ). Les adhésions focales ( AF ) sont les éléments mécano qui relient la cellule à son environnement mécanique. Parce aperçu apparaît que les processus dynamiques intrinsèques à AF et du cytosquelette serait décisif dans la transduction des stimuli mécaniques en signaux biochimiques , nous abordons la relation entre la diffusion et propriétés de liaison des protéines AF et de la rigidité de détection dans les cellules souches mésenchymateuses humaines ( hMSC ). Nous avons mis en culture primaire hMSC dérivées de moelle osseuse , sur gels de polyacrylamide' revêtus de collagène de raideur définie et contrôlée. Adhérences et / ou adhésions naissantes à la pointe de monter et démonter ou deviennent des plus grandes autorités fédérales afin de soutenir des forces contractiles plus élevés qui ont lieu à plus de rigidité de l'ECM. Pour déterminer si le chiffre d'affaires et la croissance des AF dans hMSC dépend de la rigidité de l' ECM , et de déchiffrer le rôle de la dynamique et des interactions de la signalisation des protéines d'échafaudage dans ces processus , nous avons suivi la diffusion et propriétés de liaison de FAK , paxillin , talin et vinculine dans les cellules NCSM. Nos études basées sur la microscopie de fluorescence des approches différentes FRAP ( Fluorescence Recovery après photoblanchiment ) , F ( C ) CS ( Fluorescence ( Cross) Correlation Spectroscopy ) et FRET ( de Fluorescence Resonance Energy Transfer ) par FLIM ( Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) , tous ensemble ont révélé ce que le temps de séjour de ces protéines au sein de structures FA augmente en même temps que la rigidité du substrat. Cette propriété est en corrélation avec la dynamique et l'instabilité de la composition complexe FA elle-même , ainsi que avec le comportement cellulaire dynamique , propriétés qui sont donc régis par la rigidité du substrat. En outre, nos données montrent l'existence d' embrayage moléculaire intracellulaire à plusieurs niveaux à l'échafaud FA , y compris plusieurs liaisons moléculaires rigidité dépendante avec des cinétiques différentes (ce qui signifie lien moléculaire probable avec force différente ). Surtout , nous avons montré que les monomères de Talin et vinculine se lient à l'échafaud avec plusieurs taux de dissociation rigidité dépendante et interagissent entre eux seulement quand elle est immobilisée. La proportion des espèces en interaction talin - vinculine immobilisés (pour le type sauvage vinculine ainsi que mutant constitutivement active ) était faiblement dépendante de la rigidité de l'ECM , mettant l'accent sur le rôle des protéines dynamique au lieu de proportion d'immobilisation de la rigidité mécanisme de détection. Fait intéressant , la stabilisation de talin sur le site FA par un mutant constitutivement actif vinculine est beaucoup plus forte à faible rigidité que à haute rigidité de l'ECM , révélant une puissance élevée de signalisation réglementation à faible rigidité dans ce type de cellules. Plus précisément , notre étude a porté sur la dynamique et l'organisation des autorités fédérales , considérée comme capteurs mécaniques de ECM rigidité et donc susceptibles adaptée pour soutenir les premières étapes de processus de différenciation hMSC rigidité dépendante.

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  • Détails : 1 vol. (116 p.)
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