VHH library prepared from a dromedary immunized against human erythrocytes : innovative diagnostic applications of an anti-human glycophorin A VHH

par Ibrahim Habib

Thèse de doctorat en Immunologie

Sous la direction de Olivier Bertrand.

Soutenue en 2013

à Paris 7 .

  • Titre traduit

    Librairie de VHH obtenue à partir d'un dromadaire immunisé contre des globules rouges humains : applications diagnostiques innovantes d'un VHH dirigé contre la glycophorine A humaine


  • Résumé

    Les camélidés expriment, en plus des IgGs conventionnelles, des anticorps particuliers faits seulement de chaînes lourdes; ces derniers sont fonctionnellement normaux. Le domaine responsable de la reconnaissanc de l'antigène (dit VHH) peut être clone facilement, il est facile à exprimer et peut avoir une variété d'applications thérapeutiques et diagnostiques. Nous avons criblé par le phage display une librairie de VHHs préparée à partir d'un dromadaire immunisé par transfusion de sang humain total. Nous avons obtenu plus de 200 clones de VHH anti-glycophorine A (GPA). L'un des VHHs identifiés (IH4) a été trouvé 140 fois. IH4 a été pleinement caractérisé, c'est un anti-GPA VHH il n'est pas spécifique de groupe sanguin et peut donc reconnaître les érythrocytes de quasiment tous les humains. Son épitope linéaire a été identifiée et correspond au motif YPPE. IH4 est un VHH thermostable, sa Tm est de 75,8 °C. Les procédures d'expression des VHHs ont été optimisées, actuellement quelques 120 mg de protéine par litre de milieu de fermentation peuvent être facilement obtenus. Nous avons évalué l'utilisation d'IH4 pour le design de réactifs permettant chez un patient la mise en évidence d'une immunisation grâce à l'agglutination de ses propres globules rouges à l'addition du réactif. Nous avons démontré la validité du concept pour le diagnostic d'immunisation contre le VIH en utilisant une fusion, IH4-p24 de VIH, permettant un diagnostic en 3 minutes sans avoir recours au moindre équipement. Nous avons également préparé des fusions recombinantes d'IH4 avec des antigènes du trypanosome afin de mettre en évidence l'immunisation observée au cours de la maladie du sommeil.


  • Résumé

    Camelidae express, in addition to conventional IgGs, specific antibodies composed of only heavy chains called heavy-chain antibodies, they are functionally normal. The domain responsible for antigen recognition (called VHH) can be easily cloned, it is easy to express and can have a variety of therapeutic and diagnostic applications. By phage display, a VHHs library, prepared from a dromedary immunized by transfusion of human blood, was screened, and we got more than 200 anti-glycophorin A (GPA) VHH clones. One of the identified VHHs (IH4) was found 140 times. IH4 has been fully characterized, it is an anti-GPA VHH, it is not blood antigen-specific and can therefore recognize erythrocytes of almost ail humans. Its epitope was identified and corresponds to linear sequence YPPE. IH4 is a thermostable VHH, with a Tm of 75. 8 ° C. VHHs-expression procedures were optimized, currently about 120 mg of protein can be easily got per liter of fermentation medium. We evaluated the use of IH4 for the design of reagents monitoring immunization in a patient by the agglutination of his own red blood cells over reagent addition. We have demonstrated the validity of the concept for the diagnosis of immunization against HIV using an IH4- HIV p24 fusion, allowing diagnosis in 3 minutes without the need of any equipment. We also prepared recombinant fusions of IH4 with trypanosome antigens to detect immunization observed in sleeping sickness.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (190 p.)
  • Annexes : 340 réf.

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