Avancées méthodologiques structurales sur l'Aquaporine 0 et son analyse fonctionnelle

par Alice Berthaud

Thèse de doctorat en Biophysique

Sous la direction de Stéphanie Mangenot.

Soutenue en 2013

à Paris 6 .


  • Résumé

    Les aquaporines (AQP) sont des protéines membranaires permettant le passage de l’eau à travers les membranes L’une d’entre ellesl’AQP0, est spécifique du cristallin de l’œil et présente une double fonction: (i) une fonction de canal aqueux, où les AQP0 sont en conformation dite non-jonctionelle (ii) et une fonction d’adhésion entre cellules cristallines, où les AQP0 forment un complexe dit jonctionel. À ce jour, les mécanismes et les conditions de formation du complexe ainsi que leur capacité à toujours conduire l’eau restent à ce jour inconnu. Nous avons étudié les mécanismes intervenant dans la formation des complexes jonctionels en utilisant la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS). Pour cela, nous avons développé une nouvelle méthodologie d’étude des protéines membranaires en utilisant l’AQP0 non jonctionelle comme modèle. Nous avons réussi à modéliser parfaitement les courbes de diffusion, nous permettant de déterminer l’organisation et le nombre de molécules de détergent autour d’une AQP0 non jonctionelle. Nous avons également pu montrer que l’organisation du détergent autour des AQP0 ést similaire à l’organisation au sein des micelles libres de détergents. Nous avons ensuite inséré les AQP0 au sein de vésicules unilamellaires géantes (GUV). La perméabilité des d’AQP0 a été mesurée grâce à l’application de chocs osmotiques successifs sur des GUV préalablement adhérées sur une surface. Le suivi de l’aire de contact adhérée par microscopie à contraste interférentiel, lors de l’application du choc osmotique, permet grâce à un modèle simple de déterminer la perméabilité des AQP0 insérées au sein des membranes. Les valeurs préliminaires de perméabilités obtenues pour les AQP0 non jonctionelles sont en accord avec les données de la littérature et confirment la validité de l’approche

  • Titre traduit

    Structural methodological advances on Aquaporine 0 and its functional analysis


  • Résumé

    The aquaporin (AQP) are membrane protein which permit the transport of water across membranes. Among them, the AQP0 is specific to the eye lens and carries two important features: (i) water transport across cell membranes, where the AQP0 is in a non-junctional conformation (ii) and adhesion between neighboring cells, where the junctional AQP0 of one cell interact with another junctional AQP0 of neighboring cell. So far, the mechanism involved in the formation of junction and the capability of these jonctional AQP0 to transport water are still under debate. We studied the mechanisms involved in the formation of junction between AQP0 using Small-Angle X-rays Scattering (SAXS). In this purpose, we developed a new methodology for the analysis of membrane protein in solution by SAXS using AQP0 as a model system. We successfully managed to model the SAXS scattering curves allowing us to accurately determine the organization and the number of detergent molecules surrounding a non junctional AQP0. One of our main results is that the organization of detergent around the protein is very similar to the free micelles of detergents. Secondly, we have inserted the AQP0 in giant unilamellar vesicles (GUVs). The permeability of the AQP0 has been measured by performing osmotic shock on adhering GUV using. Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM). The preliminary values obtained for the non junctional AQP0 are in good agreement with the literature and confirms the validity of the model

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Informations

  • Détails : 1 vol. (208 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 187-208. 249 réf. bibliogr.

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  • Bibliothèque : Université Pierre et Marie Curie. Bibliothèque Universitaire Pierre et Marie Curie. Section Biologie-Chimie-Physique Recherche.
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  • Cote : T Paris 6 2013 52
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