NR2C/F telomeric association drives telomere-genome rearrangements in ALT cells

par Paulina Marzec

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Jérôme Déjardin.

  • Titre traduit

    Réarrangements télomères/génome médiés par les facteurs NR2C/F dans les cellules ALT


  • Résumé

    L'immortalité cellulaire est toujours accompagnée par l'activation du mécanisme de maintien des télomères. Dans la plupart des cancers humains, ce rôle est assuré par l'enzyme télomérase. Cependant, dans 15 % des tumeurs, la télomérase n'est pas activée et les télomères sont maintenus par l'allongement alternatif des télomères (ALT), voie qui implique la recombinaison des télomères. ALT est plus fréquent dans les tumeurs provenant de tissus mésenchymateux (sarcomes), representant 40-60 % des cas, que dans les tumeurs épithéliales. Comprendre le mécanisme ALT est primordial dans les thérapies anti-cancéreuses puisque certaines drogues inhibant la télomérase conduisent souvent à l'activation de l'ALT.La voie ALT est définie par de caractéristiques typiques des télomères. Dans les cellules ALT, les recombinaisons aberrantes d'ADN ne se limitent pas aux télomères puisque les génomes sont souvent fortement réarrangés. Les liens de ces caractéristiques génomiques anormales et la maintenance des télomères atypique ne sont pas connues, mais l'instabilité du génome contribue certainement à la transformation. Notre équipe a montré que les récepteurs orphelins appartenant aux familles NR2C/F ont été trouvés enrichies dans les télomères des lignées cellulaires ALT. Nous avons proposé que ces facteurs puissent être recrutés aux télomères par liaison directe à la séquence répétée GGGTCA, un site de liaison à haute affinité pour ces protéines. Mon projet vise à comprendre (i) leur mécanisme de liaison et (ii) leur rôle, dans le processus d'ALT.Dans cette étude nous montrons que dans les sarcomes primaires humains, les télomères d'ALT sont souvent liés par des récepteurs nucléaires orphelins des sous-familles NR2C/F, en particulier dans les tumeurs au stade avancé. Ceci suggère un rôle actif de ces facteurs dans la progression tumorale ALT. En utilisant la technique de ChIP-sequencing, nous avons montré que les protéines NR2C/F se lient à une répétition directe amplifiée (DR0) aux télomères, et pas de manière significative à toute autre combinaison de motif GGGTCA. Nous avons également analysé la distribution sur tout le génome de NR2C2/F2 et TRF2, une protéine de liaison des télomères, dans des cellules ALT (-) et ALT (+). Bien qu'il n'y ait que peu de sites génomiques liés par TRF2 dans les cellules ALT (-), nous avons été surpris d'identifier plusieurs centaines de régions liées par TRF2 dans les cellules ALT (+). Plus surprenant, la grande majorité de ces régions spécifiques TRF2 ALT chevauche des sites endogènes de NR2C2/F2. Étant donné que ces sites ne contiennent généralement pas les répétitions des télomères, TRF2 est probablement recruté de façon indirecte. Conformément à cette interprétation, nous montrons que les facteurs NR2C/F entrainent un rapprochement des loci et sont responsables du regroupement atypique des télomeres dans ALT. De plus, un sous-ensemble de ces régions génomiques uniques a des additions hétérogènes des séquences télomeriques ALT, suggérant un rôle dans le recrutement des télomères par des protéines NR2C/F mais aussi une fonction de ciblage de recombinaison génomique. Systématiquement, nous trouvons que ces réarrangements des télomères/génome sont situés à proximité des motifs GGGTCA endogènes. Le caryotype spectral des lignées cellulaires ATL montre que les sites télomériques interstitielles sont fréquemment localisés aux niveaux des sites de translocations/réarrangements entre deux ou plusieurs chromosomes, ce qui est également observé dans les données de ChIPseq. Ces résultats suggèrent que les réarrangements entres les télomères et le génome pourraient participer à la formation d'un caryotype complexe ce qui caractérise environ 50% des sarcomes. De plus, l'addition de sites télomériques interstitielles dans le génome est spécifique des cellules ALT et est favorisée par les dommages de l'ADN.


  • Résumé

    Cellular immortality is always accompanied by the activation of telomere maintenance mechanism. In most human cancers this role is fulfilled by the telomerase enzyme. However in 15% of tumors, telomerase is not activated and telomeres are maintained by an Alternative Lengthening of Telomeres (ALT) pathway that involves telomere-telomere recombination. Interestingly ALT is more prevalent in tumors originating from mesenchymal tissues (sarcomas), where it is present in 40-60% of cases, than in epithelial tumors. Understanding ALT maintenance is critical since inhibiting telomerase in tumors leads to the activation of ALT. The ALT pathway is operationally defined by typical telomere hallmarks. In ALT cells, aberrant DNA transactions are not restricted to telomeres since genomes are often highly rearranged. Whether these abnormal genomic features are linked to atypical telomere maintenance is not known, but genome instability is certainly contributing to transformation. We have previously shown that orphan receptors of the NR2C/F families were enriched at telomeres in ALT cell lines. We proposed that these factors could be recruited to telomeres through direct binding to the GGGTCA variant repeat, a high affinity binding site for these proteins. My project is aimed at understanding (i) their mechanism of binding and (ii) their role, if any, in the ALT process.We show that in human primary sarcomas, ALT telomeres are often bound by orphan nuclear receptors of the NR2C/F subfamilies, particularly in more advanced-stage tumors. This suggests an active role for these factors in ALT tumor progression. Using ChIP-sequencing, we show that NR2C/F proteins bind to an amplified direct repeat (DR0) at telomeres, and not significantly to any other GGGTCA motif combination. We also analyzed the genome wide distribution of NR2C2/F2 and TRF2, a telomere binding protein, in ALT(-) and in ALT(+) cells. While there are only few genomic sites bound by TRF2 in ALT(-) cells, we were surprised to identify several hundred regions bound by TRF2 in ALT(+) cells. More surprisingly, the great majority of these ALT specific TRF2 regions overlap with endogenous NR2C2/F2 sites. Since these sites usually do not contain telomere repeats, TRF2 is likely indirectly recruited. Consistent with this interpretation, we show that NR2C/F factors drive locus proximity. Moreover, a subset of these unique genomic regions harbor heterogeneous ALT telomere sequence additions, not only suggesting a telomere recruitment role for NR2C/F proteins but also a recombination targeting function in the genome. Consistently, we find these telomere/genome rearrangements are located close to endogenous GGGTCA motifs. Next, we wanted to evaluate a role of these rearrangements in formation of complex karyotype which characterize approximately 50% of sarcomas. We found by spectral karyotyping that interstitial telomeric sites are frequently located at translocation/ rearrangements sites between two or more chromosomes, which we could also observe in our ChIPseq data. Furthermore, we demonstrate that addition of interstitial telomeric sites to the genome is enhanced by DNA damage and specific for ALT genome. Therefore we conclude that NR2C/F factors target telomere proximity to defined NR2C/F regions which enables telomere-genome rearrangements under DNA damage condition. This contributes not only to efficient telomere recombination, but also it drives further genomic instability at selected NR2C/F sites.We believe we identified a new mechanism of telomere dysfunction potentially driving targeted genome instability and mediated by NR2C/F proteins in ALT cells which probably underlie complexity of sarcomas genome. Understanding the ALT mechanism allows designing NR2C/F-targeted therapies in treatment of ALT tumors and therapies for patients treated with anti-telomerase drugs to prevent ALT appearance.

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