L'obtention des données cristallographiques de qualité supérieure des états fonctionnels de la bactériorhodopsine

par Valentin Borshchevskiy

Thèse de doctorat en Physique pour les sciences du vivant

Sous la direction de Valentin Gordeliy et de Eva Pebay-Peyroula.

Soutenue le 08-02-2013

à Grenoble , dans le cadre de École doctorale physique (Grenoble) , en partenariat avec Institut de biologie structurale (Grenoble) (laboratoire) .

Le président du jury était Martin Engelhard.

Les rapporteurs étaient Georg Büldt, Dieter Willbold.


  • Résumé

    La synthèse de l'adénosine triphosphate (ATP) est un événement clé dans la bioénergétique cellulaire. ATP synthesis est possible quand un gradient de potentiel électrochimique de protons est présent sur les membranes des cellules ou des organelles. Ce gradient est produit par les réactions d'oxydoréduction ou les réactions photochimiques qui sont contrôlées par l'enzyme. Bactériorhodopsine (bR) est la protéine la plus simple et la plus étudiée qui convertit l'énergie lumineuse en potentiel électrochimique. bR est un protéine transmembranaire de Halobacterium salinarum. bR absorbe des photons de lumière et transmet un proton à partir du cytoplasme vers l'espace extracellulaire. Grâce à sa disponibilité en relativement grandes quantités, la procédure de purification facile et stable, bR reste un des protéines membranaire les plus étudiés au cours des 40 dernières années.Pour comprendre le mécanisme moléculaire de la bR fonctionnement il faut connaître les changements structurels, provoqués par l'absorption de photon, qui accompagnent le cycle de travail des protéines et poussent à transporter le proton. Cela implique l'obtention des structures cristallographiques de bR état fonctionnel avec une résolution atomique. Selon cette approche, il est important d'avoir les cristaux protéiques très ordonnés et les méthodes de fixage des molécules de protéines dans les états intermédiaires. Les méthodes de fixage dans des conditions cryogéniques ont été développées précédemment. Les cristaux de la qualité désirée peuvent être obtenus par la cristallisation in meso où lipide mésophase bicontinue est utilisé pour la cristallisation des protéines membranaires.Le mécanisme de la cristallisation in meso est actuellement étudié pauvrement. Cette situation limite grandement son application potentielle pour des protéines membranaires. Malgré ses limites l’approche in meso a récemment permis d'obtenir les structures de base ainsi que les structures intermédiaires des états de bR. Cependant, différents groupes de scientifiques ont publié de différents structures cristallographiques des mêmes états intermédiaires. Les mécanismes de protons transport proposés par des auteurs différents sont contradictoires. Les raisons de l'absence de consensus dans les structures intermédiaires restent floues. Les raisons possibles discutées dans la littérature sont: la qualité insuffisante de la diffraction des cristaux protéiques, twinning merohedral et détérioration des cristaux par l'irradiation de rayonnement X, ainsi que la génération de nouvelles protéines états provoqués par rayons X.L'objectif de l'étude était de trier les raisons de contradictions dans le domaine de l'analyse cristallographique de bR états fonctionnels et de trouver des moyens de surmonter les problèmes connexes. Ceci implique plusieurs sous-objectifs distincts: l'étude de twinning merohedral de bR cristaux; étude des changements dans la structure bR induit par les 'irradiation de rayonnement X; étude des changements structurels dans bR par les petites doses de radiations. Un autre objectif de ce travail était d'étudier un rôle de molécules de la matrice de in meso cristallisation dans la stabilisation des cristaux de protéines membranaires.

  • Titre traduit

    Obtaining high-quality X-ray data of bacteriorhodopsin functional states


  • Résumé

    The synthesis of adenosine triphosphate (ATP) is a key event in the cell bioenergetics. ATP synthesis is only possible when a proton electrochemical potential gradient is present on the membranes of cell or organelle. This gradient is produced by enzyme-controlled redox or photochemical reactions. Bacteriorhodopsin (bR) is the simplest and most studied protein that converts light energy into electrochemical potential. Being transmembrane protein of Halobacterium salinarum it absorbs light photon and transfers a proton from the cytoplasmic to the extracellular space. Due to its availability of relatively large quantities, easy purification procedure and protein stability bR remains one of the most extensively studied membrane proteins during the past 40 years.Current state of investigated problems. To understand the molecular mechanism of bR functioning is necessary to know the structural changes caused by light absorption which accompany the protein working cycle and lead to the directional transport of the proton. It implies obtaining of X-ray structures of bR functional states with atomic resolution. Following this approach it is important to have highly ordered three-dimensional protein crystals on the one hand and effective methods of trapping protein molecules in intermediate states on the other one. Trapping procedures for bR intermediate states under cryogenic conditions have been developed previously. Crystals of the desired quality can be obtained by in meso crystallization where lipid bicontinuous mesophase is used for the crystallization of membrane proteins. The mechanism of in meso crystallization is currently poorly investigated. This situation greatly limits its potential applicability for membrane proteins. Despite its limitations in meso approach have recently made possible to obtain the ground and some intermediate states structures of bR. However, different scientific groups have published different X-ray models of the same bR intermediate states. The proposed by different authors mechanisms of proton transport are contradictory. The reasons for the lack of the consensus in intermediate structures remain unclear. The possible reasons for this contradiction which have been discussed in literature are: insufficient quality of diffraction data, merohedral twinning and radiation damage of protein crystals, as well as the generation of new protein states caused by X-ray illumination.The aim of the study was to sort out the reasons for contradictions in the field of X-ray crystallographic analysis of bR functional states and to find ways to overcome related problems. This implies several separate subgoals: study of merohedral twinning of bR crystals; study of X-ray-radiation-induced changes in bR structure; study of low-dose radiation-induced structural changes in bR structure. An additional goal of the work was to study a role of molecules of the in meso crystallization matrix in the stabilization of membrane protein crystals.

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