Développement d'une méthode de quantification absolue et multiplexe par spectrométrie de masse, pour les enzymes du métabolisme central d'Escherichia coli : application à des problématiques d'ingénierie métabolique

par Mathieu Trauchessec

Thèse de doctorat en Biotechnologie

Sous la direction de Myriam Ferro.

Soutenue le 28-11-2013

à Grenoble , dans le cadre de École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble) , en partenariat avec Biologie à grande échelle (Grenoble) (laboratoire) .

Le président du jury était Dominique Schneider.

Le jury était composé de Gwenaëlle Bestel-Corre, Hidde de Jong, Christine Carapito.

Les rapporteurs étaient Bruno Domon, Jean Armengaud.


  • Résumé

    L'ingénierie métabolique vise à développer des souches très performantes permettant de produire des composés d'intérêts. Pour cela, des modèles de prédiction des flux métaboliques sont développés (GEMs = GEnome-scale Models), intégrant un ensemble de données OMICS. En particulier, l'estimation des quantités exactes d'enzymes est cruciale afin de déterminer les paramètres cinétiques, mais reste difficile à obtenir de manière multiplexe et exacte. Ces travaux de doctorat ont permis de développer une méthode analytique afin de générer des données protéomique quantitative exactes et multiplexes, basée sur l'utilisation de protéines standards couplée à une technique de spectrométrie de masse appellée « Selected Reaction Monitoring ». Cette méthode analytique a été appliquée à une souche référence et deux souches modifiées d'E. coli, optimisées pour produire des quantités élevées de NADPH. Les résultats obtenus démontrent que ce type de données, couplées à des données de flux, permettent de distinguer différents niveaux de régulation, soit au niveau de la quantité d'enzyme, soit de l'activité enzymatique. De plus, la mesure exacte et multiplexe des quantités d'enzyme est une avancée technique majeure dans le développement de modèles prédictifs dynamiques en ingénierie métabolique.

  • Titre traduit

    Development of an absolute and multiplex MS-based quantification method for Escherichia coli central metabolism enzymes : application for metabolic engineering purposes


  • Résumé

    Metabolic engineering aims at designing high performance strains to produce compounds of interest. For this purpose and to predict metabolic fluxes, GEnome-scale Models (GEMs) are developed, integrating multi-OMICS experimental data. Particularly, accurate enzymes amounts are crucial data to determine kinetic parameters but remain difficult to obtain in a multiplexed and accurate fashion. In this Ph.D work we developed a highly accurate and multiplexed workflow for generating quantitative proteomic data, using full length protein labelled standards coupled to a mass spectrometry-based technique called Selected Reaction Monitoring. This workflow was applied to E. coli strains: a wild-type strain and two other strains optimized for higher NADPH production. Results demonstrated that such data combined with measurements of metabolic fluxes, allow apprehending different levels of regulation, namely enzyme abundance and activity. In addition, accurate measurement of enzyme concentration is a key technology for the development of predictive kinetic models in the context of metabolic engineering.


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