Internal dynamics of heme-based sensor proteins studied using advanced time-resolved optical spectroscopy

par Laura Lobato Bailón

Thèse de doctorat en Physique

Sous la direction de Marten H. Vos.

Soutenue en 2013

à Palaiseau, Ecole polytechnique .

  • Titre traduit

    Dynamique interne des protéines senseurs à base d'héme étudiée par spectroscopie optique avancée résolue en temps


  • Résumé

    Des protéines à base de l'hème sont impliquées dans une large gamme de fonctions biologiques, y compris la respiration, le transport de l'oxygène et la détoxification des xénobiotiques. Surtout, les protéines senseurs bactériens à base de l'hème exploitent les propriétés de liaison de l'hème pour détecter les gaz environnementaux. Cette thèse focalise sur l'étude de la dynamique interne des hémo-protéines senseurs à gaz 6-coordonnées CooA, de Rhodospirillum rubrum et DNR de Pseudomonas aeruginosa, qui sont impliquées dans l'adaptation du métabolisme de l'organisme à son environnement. CooA et DNR, appartenant à la famille importante de protéines catabolites activatrices des gènes, sont des facteurs de transcription qui se lient à l'ADN lors de l'activation par des molécules diatomiques gazeuses, permettant ainsi à la transcription de gènes spécifiques. Les deux protéines senseur potentiellement subissent un important changement conformationnel délocalisé lors de la liaison du ligand physiologique à l'hème (CO pour CooA et NO pour DNR). Ici des techniques avancées de spectroscopie optique sont utilisées pour étudier le mécanisme et la voie moléculaire de l'activation / désactivation dans cette classe de protéines. Des interactions protéine-ADN ont été étudiées avec des techniques de fluorescence à l'équilibre et ultrarapide femtoseconde, en utilisant des substrats d'ADN marqués. Une liaison de l'ADN, sensible au ligand physiologique, dans la gamme d'affinité nanomolaire a été déduite des expériences d'anisotropie. Du " quenching " de la fluorescence du marqueur fluorescent par transfert d'énergie à l'hème natif a été observée et la vitesse de ce processus, qui reflète la distance hème-substrat, a été déterminé directement des cinétiques mesurées de la fluorescence. Cette observation ouvre la perspective d'une cartographie des changements conformationnels globaux de la protéine à l'aide des techniques FRET résolu en temps. Les processus primaires dans les mécanismes de bascule des hémo-senseurs concernent la liaison et la dissociation du ligand de l'hème. Des expériences d'absorption femtosecondes transitoires ont été réalisées afin d'étudier la dynamique de ligands dans CooA et DNR proche de l'hème. Dans DNR, après photodissociation de NO, une recombinaison géminée particulièrement rapide et efficace a été observée. Cela renforce fortement l'hypothèse que des senseurs à NO agissent comme des pièges à ligands. En outre, les barrières énergétiques liées à la migration de CO ont été déterminées dans les deux protéines senseurs par des études de la dépendance de la température. Toutes les protéines senseurs 6- coordonnées, qui fonctionnent par l'échange d'un résidu interne et de la molécule de gaz en tant que ligand de l'hème, démontrent une recombinaison sans barrières et une évasion thermiquement activée du CO de la poche de l'hème. En revanche, la barrière pour l'évasion du CO apparaît plus faible ou même absente pour les systèmes 5-coordonnées, comme cela a été trouvé pour le senseur à hème mycobactérien DosT. Ces résultats mettent en évidence un mécanisme général, où des mouvements intra-protéiques similaires sont nécessaires pour les deux, l'échange de ligand et l'évasion de ligand. Pour des raisons de comparaison, les barrières énergétiques ont également été étudiées dans des variantes de la protéine de transfert d'électrons cytochrome c. Ici, un mécanisme plus complexe de barrières multiples dans la voie d'échappement du ligand a été déduit. Cette propriété est proposée de provenir de la nature plutôt rigide de cette protéine non-senseur, qui contient un hème 6-coordonnée et est dépourvu de voies d'entrée de ligand à l'état natif. Enfin, les processus primaires dans les domaines de l'hème, de type sauvage et de mutants, du senseur à oxygène YddV, récemment découvert dans Escherichia coli, ont été étudiés. En particulier, un rôle important dans la dynamique de ligands a été élucidé pour le résidu tyrosine distale. Ce résidu, qui forme des liaisons hydrogène avec O2 et NO liés à l'hème, a un effet remarquablement discriminant: après dissociation respective de l'hème, il assiste fortement à la reliaison de l'O2, mais favorise l'évasion du NO de la poche de l'hème


  • Résumé

    Heme-proteins are involved in a large range of biological functions, including respiration, oxygen transport and xenobiotic detoxification. Importantly, bacterial heme-based sensor proteins exploit the ligation properties of heme to sense environmental gases. This thesis focuses on internal dynamics studies of the 6-coordinate heme-based gas sensor proteins CooA, from Rhodospirillum rubrum and DNR from Pseudomonas aeruginosa that are involved in adaptation of the metabolism of the organism to their environment. CooA and DNR, belonging to the important family of catabolite gene activator proteins, are transcription factors that bind DNA upon gas activation, thus enabling transcription of specific genes. Both sensor proteins are thought to undergo a large and delocalized conformational change upon binding of the physiological ligand to the heme (CO for CooA and NO for DNR). Here advanced optical spectroscopy techniques are used to investigate the mechanism and molecular pathway of activation/desactivation in this class of proteins. DNA-protein interactions were studied with steady-state and femtosecond ultrafast time resolved fluorescence techniques, using labeled DNA substrates. Physiological ligand-sensitive DNA binding in the nanomolar affinity range was deduced from anisotropy experiments. Quenching of the fluorescence label by energy transfer to the native heme in the protein moiety of the complex was observed, and the rate of this process, reflecting the heme-substrate distance, was determined directly from the measured fluorescence decays. This observation opens the perspective of mapping out the global protein conformational changes using time-resolved FRET techniques. The primary processes in heme-based sensor switching mechanisms concern ligand binding and ligand dissociation from the heme. Femtosecond transient absorption experiments were performed in order to study the ligand dynamics in CooA and DNR in the vicinity of the heme. In DNR, upon photodissociation of NO, particularly fast and efficient geminate recombination was observed. This strongly strengthens the hypothesis that NO-sensors act as ligand traps. Also, the energetic barriers involved in CO migration have been determined in both sensor proteins by temperature dependence studies. All 6-coordinate heme-based sensor proteins that function via the exchange of an internal residue and the gas molecule as a heme ligand, display barrierless recombination and a thermally activated CO-escape out of the heme pocket. By contrast, the barrier for the CO-escape appears smaller or absent for 5-coordinate systems, as has been found for the mycobacterial heme-sensor DosT. These findings point to a general mechanism, where similar protein motions are required for both, ligand exchange and ligand escape. For reasons of comparison, the energetic barriers have also been studied in ligand binding variants of the electron transfer protein cytochrome c. Here, a more complex mechanism of multiple barriers in the ligand escape pathway was deduced. This feature is proposed to reflect the rather rigid nature of this non-sensor protein, which contains a 6-coordinate heme and is devoid of ligand entry pathways in the native state. Finally, the primary processes occurring in the wild type and mutant heme domains of the recently discovered oxygen sensor YddV from Escherichia coli were investigated. In particular, an important role in the ligand dynamics was elucidated for the distal tyrosine residue. This residue hydrogen bonds to heme-bound O2 and NO molecules and was found to have a remarkably discriminating effect: after respective dissociation from the heme, it strongly promotes O2 rebinding, but favors NO escape from the heme pocket

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  • Détails : 1 vol. (123 p.)
  • Annexes : Bibliographie : 139 réf.

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