Recherche de marqueurs pronostiques des formes sévères de dengue

par Romain Fragnoud

Thèse de doctorat en Sciences de la Vie

Sous la direction de Glaucia Paranhos-Baccala et de Frédéric Bedin.

Le président du jury était Renaud Mahieux.

Le jury était composé de Glaucia Paranhos-Baccala, Frédéric Bedin, Renaud Mahieux, Philippe Desprès, Noël Tordo, Christophe Peyrefitte.

Les rapporteurs étaient Philippe Desprès, Noël Tordo.


  • Résumé

    La dengue est une maladie virale endémique dans les pays tropicaux. Bénigne dans sa forme classique (FC), elle peut être redoutable lors de complications associées à sa forme sévère (FS). Actuellement, l’établissement du pronostic d’évolution vers une dengue sévère est peu fiable. Afin d’identifier des marqueurs précoces d’évolution vers une forme sévère, une étude de caractérisation différentielle de plasmas FC et FS prélevés précocement, a été effectuée par différentes approches de protéomique. La protéine non-structurale NS1 est une des protéines virale associée à la pathogénicité. Une méthode de profilage des plasma utilisant la technologie SELDI-TOF/MS (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time of Flight/Mass Spectrometry) couplée à un anticorps monoclonal anti-NS1 a été utilisée afin d’identifier les ligands de cette protéine. La protéine NS1 a été détectée spécifiquement dans des plasmas de patients dengue. Aucun partenaire de la NS1 n’a pu être identifié. La méthode peut néanmoins être utilisée pour sérotyper les échantillons.Une analyse différentielle en ICPL (Isotope Coded Protein Labelling) des protéines plasmatiques de patients FC ou FS a permis d’identifier trois marqueurs potentiellement liés la sévérité de la maladie qui ont été validés en ELISA. La synthèse du virus mettant en jeu des partenaires cellulaires, le viroprotéome associé à chaque pathologie a été caractérisé par LC-MS/MS. Une méthode de purification du virus de la dengue a préalablement été mise au point sur un modèle in vitro. Cette méthode a ensuite été appliquée sur des pools de plasmas de patients prélevés en phase virémique. Des protéines virales ainsi que des protéines de l’hôte potentiellement associées aux virus ont été identifiées. Après analyse, une « empreinte » mettant en jeux des voies canoniques spécifiques a pu être déterminée pour les FS. Des ELISA ont été réalisés afin de valider le différentiel d’expression sur un choix de protéines.Au-delà de l’identification d’outils susceptibles d’aider les praticiens à poser un pronostic, ces études s’inscrivent dans la compréhension des mécanismes complexes qui sous-tendent le passage d’une FC à une FS.

  • Titre traduit

    Biomarker Investigations for Severe Dengue Prognosis


  • Résumé

    Dengue is a endemic viral disease in tropical countries. If its classical form (CF) is benign, its severe form (SF) leads however to serious complications. Currently, the prognosis of severe dengue is unreliable. Differential proteomic studies on acute CF and FS plasma specimens were performed in order to identify early markers of progression to severe forms.The non-structural protein 1 (NS1) is a viral protein associated with pathogenicity. A method using SELDI-TOF/MS (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time of Flight/Mass Spectrometry) coupled to anti-NS1 monoclonal antibodies was developed in order to profile the proteins interacting with NS1 in plasma. Whereas NS1 protein was specifically detected in acute dengue plasma specimens, no NS1 ligand was identified. This method however allowed for sample serotyping.Plasma proteins of SF and CF patients were analyzed differentially using ICPL (Isotope Coded Protein Labeling). Three markers potentially related to disease severity were identified and validated by ELISA.As cellular partners are involved in virus biosynthesis, the viroproteome associated to each disease was characterized by LC-MS/MS. A method of dengue virus purification was first developed on an in vitro model. This method was then applied to pools of acute plasma of either CF or SF patients. We identified viral proteins as well as host proteins potentially associated with the viral particles. A footprint involving specific canonical pathways were subsequently identified in SF patients. Finally, a set of proteins found differentially expressed was validate by ELISA.Beyond identification of tools allowing assessment of dengue severity prognosis, these results give clues on the complex mechanisms underlying the transition from the CF to the SF.

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