Contribution of the adenine nucleotide carrier, porin, and sphingolipid metabolism to mitochondria membrane permeabilization in Saccharomyces cerevisiae

par Dario Martins Trindade

Thèse de doctorat en Sciences, technologie, santé. Biochimie

Sous la direction de Stephen Manon et de Manuela Corte Real.

Le président du jury était Maria Fernanda Proença.

Le jury était composé de Stephen Manon, Margarida Casal, Susana Chaves, Clara Pereira.

Les rapporteurs étaient Vlademar Maximo, Pedro Gaspar Moradas-Ferreira.

  • Titre traduit

    Contribution du transporteur adénine nucléotide, porine, et du métabolisme des sphingolipides à la perméabilization de la membrane mitochondrial de saccharomyces cerevisiae


  • Résumé

    La perméabilisation de la membrane mitochondriale externe (MOMP) est un évènement décisif lors de la balance entre la vie et la mort de la cellule. Les évènements biochimiques responsables de la MOMP ne sont pas encore complètement définis. Deux mécanismes majeurs et distincts ont été impliqués dans le contrôle de la MOMP: i) l'action des protéines de la famille de Bcl-2, qui peuvent directement s'insérer dans la membrane mitochondriale externe (OMM) et induire l'ouverture de pores; et ii) le pore de transition de perméabilité (PTP), un canal non sélectif de la membrane mitochondriale interne, qui induit un gonflement des mitochondries à la suite d'une ouverture prolongée, suivie d'une éventuelle rupture de la MOM. L'intérêt croissant pour la biologie de la mort cellulaire, entretenu par des contributions significatives d'études sur la levure dans la compréhension des mécanismes biologiques de base, ont amené l'eucaryote unicellulaire Saccharomyces cerevisiae sur le devant de la scène. La levure est dépourvue de certains régulateurs majeurs de l'apoptose, mais possède cependant des homologues des facteurs pro-apoptotiques mitochondriaux, ainsi que des orthologues des composantes moléculaires généralement attribuées au PTP, notamment le l'échangeur ADP/ATP (AAC) et la Porine (Por1). Ces caractéristiques de S. cerevisiae, ainsi que la disponibilité d'outils moléculaires et génétiques, ont fourni une excellente opportunité d'étudier les membres de la famille de Bcl-2 dans un environnement contrôlé, ainsi que la contribution du PTP et de ses composantes à la mort cellulaire. Dans ce travail, la contribution des groupes thiol de l'AAC, leur oxydation, Por1, et la possible interaction entre ces deux protéines, ont été explorées au cours de la mort cellulaire de la levure induite par l'acide acétique. Nous avons observé que l'oxydation de Aac2p, notamment la formation de ponts disulfures, ne contribuait pas au programme de mort induit par l'acide acétique. Cette conclusion est soutenue par l'absence d'un profil particulier d'oxydation d'Aac2p. Néanmoins, il avait été précédemment démontré que l'AAC était requis pour la relocalisation du cytochrome c induite par l'acide acétique, et que son absence promouvait la survie des cellules de levure. Par contre, la délétion de Por1 diminue la viabilité de levures traitées par l'acide acétique. Il a été émis l'hypothèse que les deux protéines participent à la même voie de régulation de la mort cellulaire. Pour la tester, la relocalisation du cytochrome c a été mesurée dans des mitochondries isolées de cellules Δaac1/2/3, Δpor1 et Δaac1/2/3Δpor1 suite à l'exposition à l'acide acétique. Les données obtenues suggèrent que l'absence de Por1 n'affecte pas la relocalisation du cytochrome c pendant la mort cellulaire induite par l'acide acétique, mais pourrait être importante pour sa régulation. Quand à la fois AAC et Por1 sont absentes, les mitochondries de levure peuvent toujours relarguer le cytochrome c, suggérant l'existence d'un mécanisme indépendant de l'AAC. De plus, nous avons montré que les deux protéines ont des effets distincts dans les réponses cellulaires à différents stress. En effet, l'absence des AACs contribue à l'augmentation de la résistance au stress osmotique et de l'intégrité de la paroi cellulaire. Enfin, S.cerevisiae a été utilisé comme modèle pour étudier les aspects mécanistiques relatifs à la fonction des protéines de la famille de Bcl-2. Notamment, nous avons évalué le rôle des sphingolipides sur l'action du régulateur pro-apoptotique humain Bax. Nous avons montré que l'absence de Isc1p, une inositol phospholipase C qui dégrade les sphingolipides complexes en céramides chez la levure, favorise la viabilité de cellules de levures exprimant une forme active de Bax. Nous avons ensuite révélé que cet effet n'est pas associé à des modifications de l'activité de Bax. Il semblerait plutôt que cet effet soit lié aux conséquences cellulaires de l'action de Bax.


  • Résumé

    A decisive event in the cell’s life-or-death decision is the mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP). The biochemical events responsible for MOMP, are not entirely defined. Two major and distinct mechanisms have been implicated in the control of MOMP: i) the action of Bcl-2 family proteins, which can directly engage the outer mitochondria membrane (OMM) and induce the opening of pores; and ii) the mitochondrial permeability transition pore (PTP), an inner membrane unselective channel that induces mitochondria swelling upon long term openings, and eventual rupture of the OMM. The growing interest in cell death biology, fostered by the relevant contributions of yeast to the understanding of basic biological processes, brought the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae into the scene. Yeast cells lack some of the major regulators of apoptosis but still possess homologues of mitochondrially enclosed pro-apoptotic factors, as well as orthologues of the molecular components generally ascribed to PTP, including the ADP/ATP carrier (AAC) and Porin (Por1). These particular features of S. cerevisiae, along with the availability of genetic and molecular tools, provided an excellent opportunity to study Bcl-2 family members in a “controlled” environment, or the contribution of the PTP and its components to cell death. In this work, the particular contribution of AAC’s thiol goups, its oxidation, Por1, and of a possible interaction between both proteins to acetic acid-induced yeast cell death, was explored. We observed that oxidative modifications of Aac2p, namely the crosslinking of thiols, do not contribute to the acetic acid-induced cell death program. Such idea is supported by the apparent absence of a particular Aac2p oxidation pattern. Nevertheless, the AAC was previously found to be required for acetic acid-induced cytochrome c release, and its absence promoted the survival of yeast cells. Deletion of Por1, on the other hand, decreased the viability of yeast cells treated with acetic acid. It was hypothesized that the two proteins could share the same pathway in the regulation of cell death. To test it, cytochrome c release was evaluated in mitochondria isolated from Δaac1/2/3, Δpor1 and Δaac1/2/3Δpor1 cells following acetic acid exposure. The data obtained suggest that absence of Por1 does not affect cytochrome c releaseduring acetic acid induced-death, but it may be important for its regulation. When both the AAC and Por1 were absent, yeast mitochondria could still release cytochrome c, raising the possibility of an AAC-independent mechanism. Furthermore, we found both proteins have distinct effects that regulate the cellular response to different stresses. Indeed, absence of the AACs somehow contributed to increased osmotic stress and cell wall resistance. Finally, S. cerevisiae was used as a model to study mechanistic aspects relative to the function of Bcl-2 family proteins. Namely, we assessed the role of sphingolipids in the action of the human pro-apoptotic regulator Bax. We found that absence of Isc1p, an inositol phospholipase C that degrades complex sphingolipids into ceramides in yeast, favored the viability of yeast cells expressing an active form of Bax. It was further revealed that this effect is not associated with changes to the action of Bax; rather, it might be related with the cellular consequences of Bax-action. A parallel with the effect of Uth1p absence in yeast cells expressing Bax suggests that the absence of Isc1p could affect the selective degradation of mitochondria by mitophagy, and thus produce a different cell death response. This work provides new insights into the physiological events underlying the contribution of mitochondrial proteins, previously associated with cell death responses, and sphingolipid metabolism to cell death induced by acetic acid and Bax, respectively. Once again, the yeast S. cerevisiae proved to be an excellent model for the research of cell life and death.


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