Visualisation des étapes précoces de la biogénèse des microARN

par Clément Bellemer

Thèse de doctorat en Biologie moléculaire

Sous la direction de Jérôme Cavaillé.

Soutenue en 2012

à Toulouse 3 .


  • Résumé

    La maturation nucléaire des primary microARN (pri-miARN) catalysée par le complexe DGCR8-Drosha (Microprocesseur) est hautement régulée. Cependant peu de choses sont connues quant à l'organisation spatiale de la biogénèse des microARN dans le noyau des mammifères. Nous avons pu visualiser pour la première fois, dans des cellules vivantes et à l'échelle du noyau unique, le cheminement intra-nucléaire d'un pri-miARN exprimé de manière endogène et généré par le cluster de microARN du chromosome 19 (C19MC) depuis son site de transcription jusqu'aux molécules uniques de pri-miARN liées à DGCR8 dans le nucléoplasme. Nous avons pu montrer que le microprocesseur et dans un moindre cas les protéines RHA, ILF3, hnRNP C1/C2 et EWS se concentrent au niveau des pri-miARN non épissés du C19MC à proximité de leurs gènes. La combinaison d'expériences de Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP), Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy (FCCS) et de depletion par ARN interférence (RNAi), apporte des évidences d'un recrutement de DGCR8 et Drosha au niveau des pri-miARN du C19MC sous la forme d'un complexe préformé qui se dissocie séparément. Notre étude par une approche d'imagerie de cellules vivantes suggère que suite à l'interaction avec les pri-miARN et probablement de manière concomitante avec le clivage effectué par Drosha, le microprocesseur subit des changements conformationnels qui permettent le relargage de Drosha alors que DGCR8 reste lié de façon plus stable aux pri-miARN.

  • Titre traduit

    Visualization of the primary steps of the miRNA biogenesis


  • Résumé

    Nuclear primary microRNA (pri-miRNA) processing catalyzed by the DGCR8-Drosha (Microprocessor) complex is highly regulated. Little is known, however, about how microRNA biogenesis is spatially organized within the mammalian nucleus. Here, we image for the first time, in living cells and at the single-gene level, the intra-nuclear trafficking of endogenously-expressed pri-miRNAs generated at the human imprinted Chromosome 19 MicroRNA Cluster (C19MC), from transcription sites to single molecules of DGCR8-bound pri-miRNA in the nucleoplasm. We report that Microprocessor and, to lesser extent, RHA, ILF3, hnRNP C1/C2, and EWS proteins, concentrate onto unspliced C19MC pri-miRNA retained in close proximity to their genes. A combination of Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP), Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy (FCCS) and RNAi experiments provides direct visual evidence that DGCR8 and Drosha are targeted to C19MC pri-miRNAs as a preformed complex but dissociate separately. Our live-cell imaging study supports the view that, upon pri-miRNA loading and most likely concomitantly with Drosha-mediated cleavages, Microprocessor undergoes conformational changes that trigger the release of Drosha while DGCR8 remains stably bound to pri-miRNA.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (176 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 150-176

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  • Bibliothèque : Université Paul Sabatier. Bibliothèque universitaire de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2012 TOU3 0060
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