Développement d'outils pour suivre la différenciation précoce de cellules souches embryonnaires

par Agata Natalia Bera

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Olivier Pourquié.

Le président du jury était Joshua Brickman.

Le jury était composé de Maria-Elena Torres-Padilla.

Les rapporteurs étaient Alexander Aulehla.


  • Résumé

    Les cellules souches embryonnaires (ES) sont des cellules pluripotentes, capables de s'auto-renouveller indéfiniment dans des conditions de culture appropriées. Cela signifie que ces cellules restent dans un état prolifératif et indifferencié en culture et ont le potentiel de se différencier dans les trois feuillets embryonnaires, à savoir l'ectoderme, le mésoderme et l’endoderme, et leurs dérivés. Cette capacité à se différencier dans tous les types cellulaires, souligne la diffculté à contrôler la différenciation des cellules ES in vitro et à les guider vers un lignage spécifique. Mon projet de thèse porte sur la différenciation des cellules ES murines. Une étape importante du développement embryonnaire est le choix entre l’ectoderme et le mésendoderme. Dans ce but, j'ai développé une lignée ES qui permet de suivre exclusivement l'expression de Brachyury (T) dans le mésendoderme à l'exclusion de la notochorde: la lignée TRepV. Pour cela, jai cloné un fragment de 1 kb du promoteur murin de Brachyuryen amont du rapporteur Venus (YFP). Avant d'utiliser cette lignée, j’ai cherché à la valider. Malheureusement l'expression du rapporteur TRepV ne reproduit pas fidèlement l'expression endogène de T. Une hypothèse est que le fragment de 1kb ne contient pas tous les éléments de régulation de T nécessaires pour expression fidèle in vitro. De manière surprenante, j’ai observé que le rapporteur TRepV est exprimé de façon hétérogène dans les cellules ES non différenciées. Au cours de mon travail de thèse, je me suis intéressée à cette expression hétérogène. J'ai montré que les cellules ES TRepV+ représentent une sous-population distincte des cellules souches, qui peut être maintenue séparément exprimant le rapporteur de manère stable, à la difference d'autres gènes exprimés de manière hétérogène dans les cellules ES. Nous avons trouvé un marqueur d'une population distincte parmi les cellules ES et de nouveaux gènes impliqués dans pluripotence, qui seront abordés dans des études futures.

  • Titre traduit

    Establishing tools to investigate and guide early embryonic stem cell differentiation


  • Résumé

    Embryonic stem cells (ESCs) are a powerful system to investigate developmental processes in vitro, and a promising tool to generate specific cell types for cellular therapies and regenerative medicine. ESCs are self-renewing, pluripotent cells, maintaining a proliferative and undifferentiated state in culture, while retaining the capacity to differentiate into the three embryonic lineages: ectoderm, mesoderm and endoderm, and all their derivatives. Here, I established a primitive streak specific Brachyury/T Reporter ESC line (TRepV) to investigate early ESC differentiation. In contrast to previously published Tknock-in line, we established a transgene T ESCs reporter line, in order to avoid the disruption of the T locus, which may result in a hapoinsuficient phenotype. During the validation process, I observed discrepancies in expression between the TRepV and the endogenous T locus. I followed upon these observations with a more detailed analysis and obtained evidence that T is regulated differently in the ESC system compared to in vivo development. Against expectations, I also observed heterogeneous expression of the TRepV reporter in undifferentiated ESCs. Undifferentiated ESCs were found to be a mix of TRepV+ and TRepV- cells. This finding became the focus of my studies: I found TRepV+ cells represent a distinct population of ESCs with a unique identity. Unlike other heterogeneous ESC populations (such as Stella or Nanog), TRepV+ cells do not interconvert in their fate and represent an explicit, stable subpopulation of ESCs. Finally, I performed a microarray analysis of TRepV+ and TRepV- ESCs and identifed new genes which may be involved in the regulation of self-renewal and pluripotency.

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