Vers une meilleure compréhension des infections intestinales : études des relations hôte-pathogène chez l'organisme modèle Drosophila melanogaster

par Arshad Ayyaz

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Dominique Ferrandon.

Le jury était composé de Jean-Luc Imler, Jean-Marc Ghigo.

Les rapporteurs étaient François Leulier, Arlette Darfeuille-Michaud.


  • Résumé

    Une partie conséquente de mon travail a été d'effectuer un crible génétique en utilisant une bibliothèque de mutants générés par insertion aléatoire de Tn5-Sm, un minitransposon bactérien. Le crible a été réalisé dans un contexte défini: celui de mouches-hôtes auxquelles manquait le gène Eater, lequel code un récepteur de phagocytose (Kocks et al., 2005). Dans ces mouches, l'infection n'est plus contrôlée dans l'hémocoele par les hémocytes et les drosophiles mutantes succombent rapidement à une bactériémie. Plusieurs phénotypes bactériens étaient attendus à l'issue de ce crible. Une première catégorie de phénotype prévisible était une virulence accrue, par exemple si les bactéries mutantes devenaientcapables de traverser plus rapidement ou efficacement la barrière intestinale conséquemment à la perte d'un régulateur négatif. Un deuxième type de phénotype attendu était une virulence atténuée pouvant s'expliquer de plusieurs manières: 1- perte de résistance à l'environnement existant dans le lumen intestinal (enzymes digestives et lysozyme, radicaux libres et peptides antimicrobiens induits au niveau de l'épithélium intestinal dans le cadre d'une réponse immunitaire locale de l'hôte); 2- incapacité à traverser la matrice péritrophique; 3-incapacité à envahir les cellules épithéliales (adhésion, pénétration); 4- incapacité à résister aux défenses intracellulaires potentielles; 5- incapacité à sortir du côté basal des entérocytes 6- incapacité à proliférer dans l'hémolymphe ou perte de la résistance à l'action de la réponse immunitairesystémique qui est, quant à elle, fortement induite en l'absence de phagocytose, laquelle empêche chez les mouches sauvages la prolifération des bactéries ayant traversé la paroi intestinale. [...] Dans le cadre d'une infection intestinale, les mouches sauvages (et imd) succombaient en six jours alors que, de manière surprenante, les mouches mutantes de la voie Toll périssaient plus lentement, une situation opposée à celle du modèle de la piqûre septique. Quelques bactéries sont capables de traverser la paroi intestinale mais sont incapables de proliférer à moins que la réponse cellulaire ait été préalablement bloquée. L'épithélium intestinal apparaissait normal à la dissection et la presque totalité des bactéries ingérées étaient tuées dans l'intestin. Après avoir exclu l'hypothèse d'une toxine sécrétée dans le surnageant des bactéries adsorbées sur le filtre sur lequel viennent se nourrir les mouches, nous avons testé l'hypothèse qu'une suractivation de la réponse immunitaire était à l'origine du décès des mouches. La génétique mettant hors de cause les peptides antimicrobiens, la voie Toll n'étant apparemment pas activée dans l'épithélium intestinal, nous avons alors étudié laréponse oxydative induite par l'ingestion de bactéries (Ha et al., 2009), laquelle est capable de tuer les mouches lorsqu'elle n'est pas régulée correctement. Là-aussi, le résultat s'est avéré négatif. En fin de compte, j'ai pu établir que la mort des mouches était due à un état de famine, confirmé par des mesures des réserves métaboliques. Mes travaux ont permis d'établir un nouveau rôle de la voie Toll dans la résistance à la famine, en présence ou absence d'infection, qui sera peut-être à mettre en relation avec un rôle métabolique de la voie Toll consistant à bloquer la voie de réponse à l'insuline lors d'une infection. En conclusion, mes travaux permettent de mieux comprendre les relations hôte-pathogènequi s'établissent lors d'une infection intestinale.

  • Titre traduit

    Towards a better understanding of intestinal infections : study of host-pathogenic relationships in the model organism Drosophila melanogaster


  • Résumé

    For the systematic study of bacteri al virulence factors, we initially planned to screen the 12,000 mutant strains of the miniTn5-Sm tranposon-induced mutant bank in a wild-type S. marcescens strain Db10. Phagocytosis-deficient eater mutant flies (Kocks et al., 2005) were used in this screen to isolate the bacterial strains mutated for virulence factors and the genes responsible for crossing the gut barrier. In the eater mutant background, flies succumb to septicemia caused by the rapid proliferation of the bacteria in the hemolymph. Out of 1348 mutant strains screened, 58 candidate mutants have been isolated. Only 20% percent of the potential mutant strains displayed an increased virulence indicating that there are very few factor(s) that negatively control the virulence program of the bacterium. The fly survival phenotypes induced by the candidate mutants isolated in the first round of screen were retested. Only those bacterial strains that were consistent with the phenotype were chosen for the molecular identification of the transposon insertion sites using one primer PCR (Karlyshev et al., 2000). Once the genes impaired in each case had been identified, they were knocked off in the S. marcescens Db10 by site specific plasmid insertion mutagenesis. A mutant strain with the transposon inserted into the fliR gene, a component of the type III flagellar protein export system, exhibited attenuation of virulence. The plasmid insertionmutant strain generated to interrupt the gene fliR reproduced the fly survival phenotyp, indicating that the fliR gene is important for the virulence of S. marcescens. The fliR mutants are able to cross the peritrophic matrix, functionally similar to the human mucus. The bacteria were found in the vicinity of the epithelial cells but were not able to efficiently invade the intestinal epithelium as compared to the wild-type strain. Consequently lower titer of FliR mutants was found in the hemolymph. The inefficiency of the FliR mutants to invade cells was also confirmed in ex-vivo assay using insect cells.I thus demonstrated that the fliR gene which is important in the motility apparatus is also required by S. marcescens for the crossing of the epithelial barrier of D. melanogaster.[...]A strong oxidative response is triggered by D. melanogaster in the midgut against commensals and pathogens (Ha et al., 2009). In order to check whether the strong oxidative immune response is eventually killing the flies themselves, hydrogen peroxide was chemically neutralized in the midgut during the S. xylosus A. oral infection. No difference inthe fly survivals was observed with or without neutralization of the oxidative response indicating that over-production of reactive oxygen species (ROS) does not seem to be responsible for the fly death caused by a very low number of bacteria. Flies could efficiently survive to killed bacteria and filtered supernatant solution from overnight bacterial culture indicating that they do not die to the toxins released by the bacteria. Most surprisingly MyD88-, the Toll pathway-, mutant flies were surviving better to S. xylosus A. oral infection. A series of experiments lead us to the finding that the flies actually succumbed to starvation when orally infected with S. xylosus and that the MyD88 is required for the starvation susceptibility in microbiota-mediated manner. In conclusion my work has lead us to the better understanding of the host-bacterial interactions in the intestine.


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