Expression spatio-temporelle de deux protéines PR du grain de raisin - dégradation au cours de l'infection par Botrytis cinerea -

par Steven Colas

Thèse de doctorat en Sciences - STS

Sous la direction de Fabienne Baillieul.

Soutenue le 28-11-2012

à Reims , dans le cadre de Ecole doctorale Sciences, technologies, santé (Reims, Marne) , en partenariat avec (URVVC) Unite de Recherches Vignes et Vins de Champagne (laboratoire) .

Le président du jury était Pierre Coutos-Thévenot.

Le jury était composé de Fabienne Baillieul, Christophe Bruel, Laurence Monti dedieu, Florence Mazeyrat gourbeyre.

Les rapporteurs étaient Marielle Adrian, Marc Bardin.


  • Résumé

    L'infection des baies de raisin par le champignon Botrytis cinerea, responsable de la pourriture grise, est fréquente et occasionne des dégâts importants. Pourtant, il semble que la baie dispose de moyens de défense parmi lesquels des protéines PR "Pathogenesis-Related". Chez le Pinot Noir, une chitinase (CHI4D) et une thaumatin-like (TL3) s'accumulent naturellement en grande quantité à partir de la véraison et présentent une activité antifongique contre B. cinerea in vitro. L'objectif de ce travail est de comprendre comment B. cinerea peut se développer sur des baies censées disposer de défenses suffisantes. Pour cela, l'expression spatio-temporelle des ARNm et des protéines CHI4D et TL3 a été suivie respectivement par hybridation in situ et immunohistolocalisation dans les baies, au cours de la maturation, à la suite d'un stress abiotique (UV-C) ou d'un stress biotique (B. cinerea). Dans des baies avant véraison (vertes), n'exprimant naturellement que très faiblement CHI4D et TL3, les ARNm et les protéines s'accumulent en grande quantité après application d'un stress abiotique (UV-C) ou biotique (infection artificielle par B. cinerea). Les protéines CHI4D et TL3 sont localisées au niveau des faisceaux conducteurs ainsi qu'au niveau des tissus proches des sites d'exposition aux UV-C (exocarpe) ou au niveau des sites d'inoculation de B. cinerea, suggérant qu'elles sont impliquées dans la défense de la baie avant véraison. Après véraison, les ARNm et les protéines sont naturellement accumulés au niveau de l'exocarpe et des faisceaux conducteurs qui correspondent à des sites potentiels d'entrée ou de propagation des agents pathogènes. Alors que l'application d'un stress UV-C sur ces baies ne provoque qu'un effet mineur sur l'expression de CHI4D et de TL3, au cours de l'infection par B. cinerea, les quantités de transcrits et de protéines diminuent. A un stade précoce d'infection, la diminution de la quantité des deux protéines est observée en avant du front de propagation du champignon, suggérant une dégradation par des protéases sécrétées par B. cinerea. A un stade d'infection plus avancé, cette diminution s'étend à l'ensemble de la baie. La production hétérologue des protéines CHI4D et TL3 nous a permis de confirmer que CHI4D pouvait être dégradée par des protéases aspartiques sécrétées par B. cinerea. La dégradation de TL3 n'a pas pu être reproduite in vitro. Des tests antigerminatifs effectués in vitro avec les protéines hétérologues n'ont pas permis de mettre en évidence d'effet antifongique malgré la présence d'une activité chitinase pour CHI4D et β-1,3,-glucanase pour TL3. Il est donc possible que ces protéines possèdent des fonctions autres que celles impliquées dans la défense.

  • Titre traduit

    Spatio-temporal study of two PR-proteins of grape berries -degradation during infection by Botrytis cinerea-


  • Résumé

    Grape berries infection by the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea, the causal agent of gray mold, is quite common and causes significant damage. However, it seems that berries have a mechanism of defense, among which are pathogenesis related proteins. In Pinot Noir grape berries, a chitinase (CHI4D) and a thaumatin-like (TL3) protein naturally accrue in large amounts from véraison and show in vitro an antifungal effect against B. cinerea. The aim of this work was to understand how B. cinerea can develop on grape berries that seem to have sufficient defense mechanisms. To do so, the spatio-temporal expression of CHI4D and TL3 mRNAs and proteins in berries was studied respectively by in situ hybridization and immunohistolocalization during maturation, after an abiotic stress (UV-C) or a biotic stress (B. cinerea). Before véraison (green berries) while the expression of CHI4D and TL3 is naturally low, mRNAs and proteins have accumulated in large amounts in berries after UV-C exposition or artificial infection with B. cinerea. CHI4D and TL3 proteins have accumulated around vascular bundles as well as near the sites of UV-C exposition (exocarp) or B. cinerea inoculation, suggesting that before véraison these proteins could be involved in the berry defense. After veraison, mRNAs and proteins naturally accumulate in the exocarp and around vascular bundles that correspond to potential sites of penetration or propagation of pathogenic agents. While the application of UV-C stress on these berries causes only a minor effect on the expression of CHI4D and TL3, during infection by B. cinerea, the amounts of mRNA and proteins decreased. At an early stage of infection, the less amounts of both proteins were observed around the fungus propagation area, suggesting that these proteins could be degraded by B. cinerea secreted proteases. At a more advanced stage of infection, the decrease extended to the entire berry.Production of heterologous CHI4D and TL3 proteins allowed us to confirm that CHI4D could be degraded by aspartic proteases secreted by B. cinerea whereas no degradation of TL3 could be observed in vitro. Both heterologous proteins showed no antifungal effect while a chitinase and a β-1,3-glucanase activities were observed respectively for CHI4D and TL3. It is therefore possible that these proteins have other functions than those involved in the defense.


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