Variabilité phénotypique et épissage : combinaison d'analyses in vitro et in silico du gène CFTR

par Abdelrazak Aissat

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Pascale Fanen.

Le président du jury était Jorge Boczkowski.

Le jury était composé de Pascale Fanen, Sylvie Tuffery-Giraud.

Les rapporteurs étaient Didier Auboeuf, Fabrice Lejeune.


  • Résumé

    Depuis plusieurs décennies, l’étude des conséquences des mutations pathogéniques a permisnon seulement de définir l’origine de nombreuses maladies génétiques humaines, héréditaires ou non,mais également de contribuer à l’interprétation de la variabilité phénotypique inter-individus au seind’une pathologie donnée. Les mutations induisant une perte de fonction de la protéine synthétisée ouune protéine incomplète ont été et sont encore les plus étudiées. Avec l’introduction des technologiesde séquençage à haut-débit, le nombre de variants faux-sens, silencieux ou introniques détectés auniveau des gènes humains augmente de façon continue. Distinguer les variations nucléotidiques quivont modifier significativement un phénotype de celles qui seront neutres est un véritable défi pour larecherche.De nombreuses variations nucléotidiques à signification clinique inconnue ont été identifiéesparmi les près de 2000 mutations décrites au niveau du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembraneconductance Regulator) responsables de la mucoviscidose. Certaines de ces variations vont avoir unimpact sur les transcrits ARN modifiant leur qualité et leur quantité et par conséquent l’expression dugène CFTR. Elles vont notamment affecter l’épissage de l’ARN pré-messager en altérant des signauxreconnus par la machinerie cellulaire et perturber la fidélité de ce mécanisme. Malgré un recul de plusde 20 ans dans la description de la corrélation génotype-phénotype dans cette maladie, de nombreuxphénotypes inattendus et atypiques sont observés. Ils peuvent être dus à des facteurs autres que desvariations génotypiques, mais sans l’accès direct aux transcrits des individus porteurs de tels variants,il est difficile de mesurer les conséquences de ces variations sur la synthèse et la maturation de l’ARN.L’objectif de ce travail de thèse a été de montrer, par des approches in vitro etbioinformatiques, comment des variations nucléotidiques au sein du gène CFTR peuvent impacter surl’épissage de l’ARN pré-messager. Ce travail a permis dans un premier temps la découverte demécanismes d’épissage inattendus modificateurs de phénotypes sévères attendus pour une mutationnon-sens. En effet, par un épissage alternatif subtil de trois nucléotides au niveau d’un site d’épissageen tandem, le codon stop se retrouve délété et aboutit à des transcrits fonctionnels expliquant lesphénotypes modérés. Dans un second temps, nous avons montré que plusieurs mutations non-sensportées par le même exon 15 impactaient différemment sur l’épissage de l’ARN en modifiantsignificativement le taux d’inclusion de cet exon. La connaissance préalable des ratios de transcritsincluant ou non l’exon peut améliorer l’efficacité des traitements correcteurs de codons stopprématurés en les combinant avec des traitements modulateurs de l’épissage augmentant le taux detranscrits correctibles. Dans un troisième et dernier temps, une combinaison d’analyses in silico et invitro des exons du gène CFTR a permis de détecter des exons porteurs de signaux d’épissage plusfaibles les rendant plus sensibles à des mutations exoniques d’épissage. Des mutations faux-sens auniveau de l’exon 3 ont par exemple été montrées comme favorisant l’exclusion de cet exon, diminuantle taux de transcrits fonctionnels.L’ensemble de ces travaux a contribué à comprendre les conséquences de mutations au niveaude l’épissage du gène CFTR sur les variations du phénotype. La connaissance améliorée des variationspossibles du phénotype rattaché à un génotype donné permettra non seulement de prédire l’évolutionde la maladie, mais également d’ajuster et de proposer des thérapies personnalisées selon la mutationportée par le patient.

  • Titre traduit

    Phenotypic variability and splicing : combined in vitro and in silico analyses of the CFTR gene


  • Résumé

    Over the past decades, studying the consequences of pathogenic mutations has allowed not only todefine the origin of several genetic diseases, but also to contribute to understand the phenotypicvariability between individuals within a disease. The CFTR gene was extensively analyzed since 1989,but among the over 1,900 mutations identified, the current challenge is to classify them as diseasecausingor neutral. These variants of unknown clinical significance (UVs) can alter multiple processes,from gene transcription to RNA splicing or protein function. The CFTR gene needs to include intactversions of all its 27 exons to be functional, and any mutation affecting its splicing process will reducethe amount of functional full-length transcripts. Previous studies have shown that mutations withinsome CFTR exons increase exon skipping. We hypothesized that a number of UVs occurring in otherCFTR exons could indeed affect splicing. By combining in vitro and bioinformatics approaches, weshowed how nucleotide variations within the CFTR gene could impact on the splicing of its premRNA.This work enabled us to provide the first experimental evidence of a premature terminationcodon removal by alternative splicing at a NAGNAG acceptor splice site. This unexpected phenotypemodifyingmechanism explains the much milder phenotype severity than expected for a nonsensemutation. The correction of premature termination codons (PTCs) by agents that promote readthroughrepresents a promising emerging tool for the treatment of many genetic diseases. Having demonstratedthat nonsense mutation could cause aberrant splicing, we postulated that the efficiency of thereadthrough treatment could be due not only to the stop codon itself but also to the amount ofcorrectible transcripts. We showed that a subset of nonsense mutations within the CFTR exon 15 has adifferent impact on the splicing efficiency by modifying the inclusion rate of this exon anddemonstrated that the total amount of transcripts together with the splicing profile should be assessedto anticipate and improve efficacy of readthrough therapy in CF patients. Finally, in order to anticipatethe occurrence of “splicing-causing” mutations, we used a combination of in silico and in vitroanalyses of all CFTR exons and pinpointed those harboring weak splicing signals, which render themmore sensitive to exonic splicing mutations.All these studies contribute to expand our knowledge on the phenotypic variability due to alternativesplicing of the CFTR gene. These studies will lead not only to predict the evolution of a disease, butalso to adjust therapy according to the mutation of each patient.

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