Wound healing signals mediated by Rho/ROCK activation in response to radiotherapy and consequences fot treatmeny of late damage within normal tissues

par Nadia Pasinetti

Thèse de doctorat en Radiobiologie

Sous la direction de Giampiero Carosi et de Jean Bourhis.

  • Titre traduit

    Signaux de cicatrisation médiées par l'activation de la voie Rho/ROCK en réponse à la radiothérapie et conséquences pour le traitement de dommages choroniques des tissus normaux


  • Résumé

    La Radiothérapie occupe la deuxième place dans la liste de traitement du cancer le plus important après chirurgie. Le progrès technique récent, comme la radiothérapie avec modulation d'intensité (IMRT) ou la radiothérapie guidée par l'image (IGRT), en combinaison avec de nouveaux médicaments à action spécifique tels que les anticorps monoclonaux, sont une garantie d'augmentation de l'index thérapeutique. Cependant, la radiothérapie peut provoquer un’ altération du processus normal de réparation et d'induire le développement d'un cadre de fibrose dans un sous-ensemble de patients sensibles et dans les survivants à long terme au cancer. La principale caractéristique de la fibrose radio-induit est l'accumulation excessive et anormale de collagène composé principalement des éléments fibrillaire et immatures de la matrice extracellulaire (ECM).Les organes qui peuvent être touchés par ce phénomène sont le foie, la peau, les intestins, les reins et les poumons. D'un point de vue clinique, la fibrose peut être considérée comme une condition irréversible, sans solution. Nous et d'autres ont récemment montré que, outre l'activation de la TGF-β/Smad canonique, d'autres voies sont activées dans les tissus fibreux tels que la cascade de signalisation intracellulaire Rho/ROCK. Fait intéressant, la façon dont Rho/ROCK semble spécifiquement activé dans la fibrose intestinale radio-induite, fournis une justification pour un stratégie anti-fibrotique ciblé. L’ inhibition pharmacologique de Rho avec les statines, en fait, est en mesure de prévenir et même inverser les phénomènes de fibrose post-actinique intestinale.Avec ces prémisses, dans nos études, nous avons montré le rôle des statines (Simvastatine et Pravastatine) et d'un inhibiteur spécifique de ROCK (Y-27632) dans un modèle murin de fibrose pulmonaire obtenue avec une approche pharmacologique (Bléomycine - BLM) . Par la suite, nous avons développé un modèle de fibrose pulmonaire induite par l'irradiation complet du thorax et évalué la réponse à l'administration de la Pravastatine. La confirmation de la participation de la voie Rho/ROCK/CTGF dans la fibrose pulmonaire a été montré par immunohistochimie: le traitement à la Pravastatine normalise l'expression de trois marqueurs: RhoB, TGFβ-RII et CTGF.Après, dans deux modèles de fibrose radio-induite (intestinal et pulmonaire), nous avons analysé, grâce à l’immunohistochimie, les mécanismes sous-jacents l'action antifibrotique de la Pravastatine via l’axe MMP2-TIMP2. Très intéressant, quand la pravastatine a été administré à titre préventif ou curatif, nous avons trouvé un impact différent sur la fibrolyse.Enfin, in vitro, nous avons étudié par zymographie l'expression des gélatinases (MMP2 et MMP9) dans des cultures primaires des fibroblastes pulmonaire murins exposées à différentes doses de rayonnement et de Pravastatine. Le métalloprotéases semble être à son tour impliquée dans les mécanismes pro-fibrolytiques induits par les statines.Dans notre modèle animal de fibrose pulmonaire, la Pravastatine est capable d'inverser le processus fibrotique et les métalloprotéases semblent être impliqués à leur tour, in vivo et in vitro, dans les mécanismes pro-fibrolyse induits par le médicament.La multiplicité des acteurs impliqués dans la physiopathologie de lésions fibrotiques explique pourquoi la mise en place d'une stratégie thérapeutique efficace est si complexe. La recherche dans les processus mécaniques de dommages aux tissus normaux ont ouvert la voie à de nouvelles approches thérapeutiques. Ces nouvelles cibles comprennent la réduction de l’inflammation, de l'activation vasculaire et de la thrombose, ainsi que la découverte de nouvelles cibles moléculaires. Il existe une variété de modèles précliniques et des stratégies efficaces, mais de nombreux efforts doivent être déployés pour atteindre l'objectif difficile de protéger les tissus normaux des effets secondaires de la radiothérapie.


  • Résumé

    Radiotherapy is the second most important treatment modality after surgery in the treatment of cancer. Recent technical advancements, such as intensity-modulated radiation therapy (IMRT) or image-guided radiation therapy (IGRT), combined with new targeted drugs have significant promise for therapeutic outcome. However radiation treatment could result in disabling normal tissue injury and in the development of progressive fibrosis in a subset of sensitive patients and in long-term cancer survivors. The main feature of tissue fibrosis is excessive accumulation of abnormal and cross-linked collagen mainly composed of fibrillar and immature extracellular matrix (ECM) components.The organs that can be affected by this phenomenon are liver, skin, intestine, kidneys and lungs. From a clinical point of view, fibrosis can be seen as an irreversible condition, without solution. We and others recently showed that beside the activation of the canonical TGF-β/Smad pathway, other intracellular signaling cascades including the Rho/ROCK pathway are switched on in fibrotic tissues. Interestingly, the Rho/ROCK pathway seems differentially activated in radiation-induced intestinal fibrosis, thereby providing a rationale for a specific, targeted anti-fibrotic strategy. Pharmacological inhibition of Rho using statins indeed prevent and even reverse intestinal radiation fibrosis.In our studies, we showed the role of Statin (Pravastatin e Simvastatin) and a specific inhibitor ROCK inhibitors (Y-27632) in a mice model of pulmonary induced-fibrosis obtained by a pharmacological approach (Bleomycin – BLM). Indeed, we developed a model of lung fibrosis by complete irradiation of chest and tested Pravastatin action. Confirmation of the involvement of Rho/ROCK/CTGF pathway in lung fibrosis are shown by immunohistochemistry: Pravastatin-treament normalized the expression of three markers: RhoB, TGF-RII and CTGF.Then, in models of radiation induced gut and lung fibrosis, we analysed, from a immunohistological point of view, the underlying mechanisms of the antifibrotic action of Pravastatin via MMP2-TIMP2 axis. Interestingly we found a different impact on fibrolysis when Pravastatin was administered preventively or curatively.Finally, in vitro, we investigate by zymography the expression of Gelatinases (MMP2 and MMP9) in primary lung fibroblasts cultures exposure at the different radiation and Pravastatin doses. Metalloproteases would appear to be in turn involved in pro-fibrolytic mechanisms induced by statin.The multiplicity of actors involved in the pathogenesis of fibrotic lesions explains why the definition of an effective therapeutic strategy is so complex.Researches in mechanistic processes of normal tissue damage paved the way for new therapeutic approaches. These new targets include reduction of vascular activation, inflammation and thrombosis and new molecular targets definition. Effective strategies are multiple on preclinical models, but numerous efforts have to be made to achieve the complicated goal of protection of normal tissues from the side effects of radiation therapy.


  • Résumé

    La radioterapia è la seconda modalità di trattamento più importante dopo chirurgia neltrattamento delle neoplasie. I recenti progressi tecnici, come la terapia ad intensità modulata(IMRT) o l’image-guided radioterapia (IGRT), in combinazione con nuovi farmaci ad azionemirata come gli anticorpi monoclonali, costituiscono ulteriore garanzia di incrementodell’indice terapeutico. Tuttavia il trattamento radiante può causare un’alterazione delnormale processo di riparazione e indurre lo sviluppo di un quadro di fibrosi in unsottogruppo di pazienti sensibili e nei lungo-sopravviventi al cancro. La caratteristicacardinale della fibrosi radioindotta è l’eccessivo ed anomalo accumulo di collagene compostoprincipalmente di componenti fibrillari e immature della matrice extracellulare (ECM).Gli organi che possono essere interessati da questo fenomeno sono fegato, pelle,intestino, reni e polmoni. Da un punto di vista clinico, la fibrosi può essere vista come unacondizione irreversibile, senza soluzione. Noi ed altri recentemente abbiamo mostrato cheaccanto alla attivazione della via canonica TGF-β/Smad, altre vie vengono attivate nei tessutifibrotici come la cascata di segnalazione intracellulare della via Rho/ROCK. Interessantenotare che la via Rho/ROCK sembra specificatamente attivata nella radiazione indotta fibrosiintestinale, fornendo così una spiegazione razionale per una specifica, mirata strategia antifibrotica.L'inibizione farmacologica di Rho con le statine infatti è in grado di prevenire eaddirittura invertire i fenomeni di fibrosi intestinale post-attinica.Grazie a queste premesse, nei nostri studi, abbiamo mostrato il ruolo delle statine(Pravastatina e Simvastatina) e di uno specifico inibitore di ROCK (Y-27632) in un modellomurino di fibrosi polmonare indotta ottenuto con un approccio farmacologico (bleomicina -BLM). In seguito, abbiamo sviluppato un modello di fibrosi polmonare indottadall’irradiazione completa del torace e valutata la risposta alla somministrazione dellaPravastatina. In questo modello ed in un modello di fibrosi intestinale indotto da radiazioni,abbiamo analizzato, da un punto di vista immunoistologico, i meccanismi sottostanti l'azione9antifibrotica della pravastatina e il ruolo delle metalloproteasi (MMP2 e TIMP2). Infine, invitro, abbiamo indagato, mediante zimografia, l'espressione delle gelatinasi (MMP2 e MMP9)in culture primarie di fibroblasti polmonari murini esposti a differenti dosi di radiazione epravastatina.Nel nostro modello animale di fibrosi polmonare, la Pravastatina è in grado di renderereversibile il processo fibrotico e le metalloproteasi parrebbero essere a loro volta coinvolte,in vivo and in vitro, nei meccanismi pro-fibrolitici indotti dal farmaco.La molteplicità di attori coinvolti nella patogenesi delle lesioni fibrotiche spiegaperché la definizione di una strategia terapeutica efficace è così complessa. Ricerche neiprocessi meccanicistici di danno ai tessuti normali hanno aperto la strada a nuovi approcciterapeutici. Questi nuovi obiettivi comprendono la riduzione dell’ attivazione vascolare,dell'infiammazione e della trombosi, oltre alla definizione di nuovi target molecolari. Esistonomolteplici ed efficaci strategie su modelli preclinici, ma numerosi sforzi devono essere fattiper raggiungere il complicato obiettivo di proteggere i tessuti normali dagli effetti collateralidella radioterapia.


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