Mise au point d'un dosage de l'activité kinase de la protéine DYRK1A et Régulation épigénétique de l'expression du gène codant le facteur de transcription ISL1

par Laure Tabouy

Thèse de doctorat en Biomolécules, biologie structurale, pathologies et biothérapies

Sous la direction de Jean-Noël Laverrière et de Julien Dairou.

Soutenue en 2012

à Paris 7 .


  • Résumé

    Le Syndrome de Down, aneuploïdie la plus courante, a pour cause première la présence d'un chromosome 21 Numéraire. L'établissement de cartes de corrélation génotypes/phénotypes chez les patients atteints du Syndrome de Down a permis de mettre en évidence la kinase DYRKIA, codée par le gène DYRKIA localisé dans la région DCR-1 du chromosome 21, comme candidat pouvant être impliqué dans l'apparition d'un retard mental. Comprendre le rôle et la régulation de DYRKIA est donc essentiel et pour cela, utiliser un test fiable de mesure d'activité de l'enzyme est indispensable. Nous avons développé une nouvelle méthode de dosage de l'activité kinase de DYRKIA utilisant la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). Cette méthode s'est révélée très sensible et peu coûteuse. En utilisant cette nouvelle méthode, nous avons confirmé les principales données obtenues in vitro sur l'activité de DYRKIA. Nous avons également caractérisé le comportement d'inhibiteurs connus de DYRKIA (harmine) et confirmé les résultats rapportés dans la littérature. En collaboration avec l'équipe du Dr. Dodd nous avons criblé des dérivés hétérocycliques azotés de faible poids moléculaire, inhibiteurs potentiels de DYRKIA. Enfin, le test d'activité a été utilisé ex vivo sur des extraits de cerveau de souris. Nos résultats indiquent que cette nouvelle méthode de dosage d'activité kinase est spécifique, reproductible et rapide. Elle peut potentiellement s'appliquer à d'autres kinases, phosphatases et plus largement à d'autres enzymes catalysant une réaction de modification de protéines.

  • Titre traduit

    Development of a kinase activity assay of DYRKIA protein : a candidate of mental retardation anddegeneration in Down syndrome


  • Résumé

    La GnRH joue un rôle essentiel en régulant la sécrétion et la synthèse de LH et de FSH via des récepteurs spécifiques (GnRHR) exprimés à la surface des cellules gonadotropes hypophysaires. L'expression tissulaire spécifique du Gnrhr est contrôlée par une combinatoire bien définie de facteurs de transcription comportant trois acteurs majeurs, SF1, LHX3 et ISL1. Au contraire du Gnrhr, nous montrons que les séquences régulatrices d'M7 en amont du site d'initiation de transcription (TSS) sont insuffisantes pour diriger l'expression hypophysaire spécifique, suggérant l'existence de mécanismes additionnels. De fait, les régions régulatrices (ou promoteurs) ainsi que les "corps" des gènes sont altérés par des modifications épigénétiques. Les résultats, obtenus par immunoprécipitation de la chromatine, montrent que dans les lignées cellulaires exprimant Isl1, notamment les cellules gonadotropes, Isl1 est complexé avec des histones H3 triméthylées sur la Lys4 (H3K4Me3) au niveau du TSS, une marque d'histones corrélée avec les gènes actifs. En revanche, dans les lignées cellulaires où Isll est silencieux, il est complexé avec des histones H3 triméthylées sur la Lys27, marque liée à la répression des gènes. On observe cette même corrélation au niveau du TSS du Gnrhr. De plus, notre étude suggère que la méthylation de F ADN, en amont de l'îlot CpG est inversement corrélée à l'activité de ce gène. Ces données suggèrent que les modifications épigénétiques sont essentiellement responsables de l'expression hypophysaire spécifique d'/s/ycontrairement à l'expression du Gnrhr qui semble principalement dépendante de la présence de facteurs de transcription tissulaires spécifiques majeurs.


  • Résumé

    Down syndrome is the most common aneuploidy, it originates from the presence of an extra 21st chromosome. The establishment of genotype/phenotype correlations in patients with Down's syndrome made it possible to highlight the DYRKIA kinase, encoded by the DYRKIA gene localized in the region DCR-1 on 21st chromosome, as a good candidate in the onset of mental retardation. Understandïng the role and regulation of DYRKIA is thus necessary and for that, to get a reliable kinase activity assay is essential. First, we focused on the establishment of a new method of DYRKIA kinase activity assay using High Pressure Liquid Chromatography (HPLC). This method proved to be highly sensitive and affordable. Second, we sought to confirm previous data on in vitro activity of DYRKIA by using this new method. We also characterized the behavior of known inhibitors of DYRKIA (harmine) and the results obtained are in agreement with the literature. In collaboration with Dr. Dodd's team, we screened various molecules as potential inhibitors of DYRKIA. Finally, the activity assay was tested ex vivo, in mice brain extracts. Our results indicate that this new method of kinase activity assay is specific, reproducible and fast. This method can be potentially applied to other kinases, phosphatases and more broadly to other enzyme catalyzing a reaction of protein modification.

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  • Détails : 1 vol. (253 p.)
  • Annexes : 551 réf.

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  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2012) 169
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  • Cote : MFTH 10277
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