Collagen 3D matrices as cellular and acellular model systems to study the role of "mineralizing" proteins : the case of DMP1

Matrices 3D de collagène en modèle cellulaire et acellulaire pour l'étude de protéines << minéralisantes >> : le cas de DMP1

• Auteur / Autrice : Jérémie Silvent
• Direction : Marie-Madeleine Giraud-Guille, Jean-Yves Sire
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biominéralisation et Evolution
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Paris 6

Mots clés

Mots clés contrôlés

Évolution (biologie)

Ostéoblastes

Minéralisation (biologie)

Résumé

The bone is an extremely complex structure, which closely associates cells, extracellular matrix, with collagen and, and an apatite mineral network. Although bone is one of the most studied living materials, the exact roles of non collagenous proteins as nucleator or inhibitor of the mineral phase are still controversial. The aims of the present study were to validate two different matrices, the one at 40 mg/mL mimicking osteoid tissue, the other at 250 mg/mL mimicking compact bone, used to better understand the role of “mineralizing” proteins, and in particularly DMP1 (Dentin Matrix Phosphoprotein-1), an acidic, highly phosphorylated, noncollagenous protein secreted during dentin and bone formation. The 60 day in vitro study showed that primary human osteoblasts seeded on dense 3D collagen matrices display features that are characteristic of active bone cells in vivo (adhesion, proliferation, morphology, mineralization, protein and gene expression). Then, the evolutionary analysis of DMP1 was useful for detecting new, potentially important motifs conserved during 220 millions years; some motifs could play a role in the mineralization process, due to the presence of numerous acidic residues. We have tested the possible function of these highly conserved motifs using a recombinant DMP1 (rDMP1), designed in the region which included the two collagen binding sites and the highly conserved acidic motifs. DMP1 was shown to play a role in the mineralization, as nucleating the mineral phase inside the collagen fibrils and inhibiting the ectopic mineralization. Our model provided similar results to the in vivo conditions, in term of morphology and nature of the mineral phase

L’os est un tissu biologique complexe, combinant des cellules, une matrice extracellulaire constituée de collagène et de protéines non collagéniques, et une phase minérale apatitique. L’initiation, de la croissance et de l’inhibition de la phase minérale sont contrôlées par des macromolécules matricielles dont le rôle exact reste à préciser. Le présent travail a eu comme objectif d’utiliser deux types de matrices de collagène, l’une à 40 mg/mL mimant le tissu ostéoïde, l’autre à 250 mg/mL mimant l��os compact Le but étant de mieux comprendre le rôle de protéines dites « minéralisantes » dans la minéralisation, et en particulier, celui de DMP1 (Dentin Matrix Phosphoprotein-1). Une première étude a consisté à suivre sur le long terme (60 jours) le comportement d’ostéoblastes primaires humains, ensemencés sur une matrice de type ostéoïde, en termes de viabilité et de phénotype (morphologie, minéralisation, expression génique). Ensuite, l’analyse évolutive de DMP1 a permis de mettre en évidence des motifs probablement fonctionnels, car conservés durant 220 millions d’années, certains d’entre eux, situés dans la région C-terminale, pouvant jouer un rôle dans la minéralisation, car riches en résidus acides. Un peptide recombinant de DMP1 a alors été élaboré, à partir de la région contenant ces motifs fortement conservés, et potentiellement essentiels à la minéralisation. Une nucléation du minéral au sein des fibrilles de collagène a été observée, ainsi qu’une inhibition de la minéralisation ectopique. La morphologie et la nature de phase minérale observée est semblable à ce qui est décrit in vivo