Analyse structure-fonction de la régulation du facteur d'élongation de la transcription P-TEFb par les protéines HEXIM1 et HIV-1 TAT

par Nina Verstraete

Thèse de doctorat en Biologie moléculaire de la cellule

Sous la direction de Olivier Bensaude.

Soutenue en 2012

à Paris 6 .


  • Résumé

    La transcription par l’ARN Polymérase II des gènes codant pour les protéines endogènes et virales est bloquée lors d’une pause transcriptionnelle intervenant à proximité du site d’initiation. Le facteur positif d’élongation de la transcription (P-TEFb) est nécessaire pour lever cette pause ainsi que pour la maturation co-transcriptionnelle des ARN pré-messagers. L’activité du P-TEFb, composé d’une kinase (CDK9) et d’une cycline (CycT1), est elle-même finement régulée. L’association ARN/protéine entre l’ARN non-codant 7SK et la protéine HEXIM1 inhibe le P-TEFb via l’assemblage d’un large complexe inactif. Cependant, les mécanismes moléculaires conduisant à son recrutement, activation et inactivation restent mal compris. Cette thèse apporte de nouvelles informations sur l’interaction entre la CycT1 et HEXIM1. Des résidus de CycT1 nécessaires pour lier HEXIM1 ont été identifiés par mutagénèse aléatoire et crible en double-hybride inverse. Leur différent rôle sur l’activité du P-TEFb ‘cartographie’ leur impact allostérique sur CDK9 et souligne l’importance de la conformation active du P-TEFb pour lier son inhibiteur HEXIM1. De plus, les zones de contact avec HEXIM1 identifiées sur la CycT1 recouvrent partiellement la surface de contact avec la protéine Tat du VIH-1, corroborant ainsi l’interaction compétitive entre Tat et HEXIM1 pour la CycT1 observée dans d’autres études. L’identification bioinformatique d’homologues putatifs d’HEXIM1 et de l’ARN 7SK chez les nématodes est aussi abordée et il est démontré en particulier que plusieurs résidus-clés de l’interaction CycT1/HEXIM1 sont conservés chez C. Elegans, supportant ainsi l’existence d’homologues réels chez les nématodes.

  • Titre traduit

    Structure-function analysis of the regulation of the positive transcription factor P-TEFB (CDK9/CYCT1) by HEXIM1 and HIV-1 TAT proteins


  • Résumé

    Transcription of endogenous and viral genes by RNA Polymerase II is blocked during the promoter-proximal pausing. The positive transcription elongation factor (P-TEFb) is required to release this pause and to allow co-transcriptional pre-mRNA processing. P-TEFb is composed of a kinase (CDK9) and a cyclin (CycT1), and its activity is itself finely regulated. The RNA/protein association between 7SK non-coding RNA and HEXIM1 protein inhibits P-TEFb through the assembly of a large inactive complex. However, the molecular mechanisms underlying its recruitment, activation or inactivation remain to be understood. This thesis provides new insights into CycT1/HEXIM1 interaction. CycT1 residues critical for HEXIM1 binding were identified through random mutagenesis and a reverse two-hybrid screen. Their different effect on P-TEFb transcriptional activity ‘maps’ their allosteric impact on CDK9 and underscores the importance of P-TEFb active conformation to bind its inhibitor HEXIM1. In addition, contact surfaces to HEXIM1 identified on CycT1 partially overlap HIV-1 Tat binding surface, accounting for the competitive binding between Tat and HEXIM1 to CycT1 observed in other biochemical studies. The bioinformatic identification of putative homologues of HEXIM1 and 7SK RNA in nematodes is also discussed and it is demonstrated in particular that several key residues in CycT1/HEXIM1 interaction are conserved in C. Elegans, supporting the existence of true homologues in nematodes.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (246 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 217-246. 369 réf. bibliogr.

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  • Cote : T Paris 6 2012 338
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