Étude de la respiration "nitrate-NO" dans l'interaction symbiotique entre Medicago truncatula et Sinorhizobium meliloti : à la recherche d'un transporteur de nitrite mitochondrial

par Marianne Prevot

Thèse de doctorat en Biologie moléculaire et cellulaire des interactions

Sous la direction de Renaud Brouquisse.

Soutenue en 2012

à Nice .


  • Résumé

    Les symbioses entre les légumineuses et les bactéries fixatrices d’azote (rhizobium) représentent un enjeu majeur pour la réduction des intrants azotés en agriculture. La réduction de l'azote moléculaire (N2) en ammonium (NH4+) par la nitrogénase bactérienne, puis son assimilation par la cellule végétale constituent la fonction centrale des nodosités symbiotiques. Ce processus, très coûteux en énergie, présente le paradoxe de se produire dans un organe très appauvri en oxygène, ce qui conduit à fortement réduire la respiration mitochondriale, principale source d'ATP. La question se posait donc de savoir par quels mécanismes l'ATP nécessaire au fonctionnement cellulaire est régénéré au sein de la nodosité. Sur la base d'observations récentes faites dans les racines en hypoxie, nous avons posé l'hypothèse selon laquelle, dans la nodosité fixatrice d'azote, une partie de l'ATP est régénérée par le biais d'une respiration cyclique (respiration nitrate-NO) en quatre étapes: 1) le nitrate (NO3-) est réduit en nitrite (NO2-) dans le cytosol par la nitrate réductase (NR); 2) le NO2- est transporté du cytosol dans la mitochondrie par l'intermédiaire d'un (ou plusieurs) transporteur(s); 3) le NO2- est réduit en oxyde nitrique (NO) par les électrons de la chaîne respiratoire (permettant ainsi le fonctionnement de la respiration et la régénération de l'ATP); et 4) le NO diffuse librement vers le cytosol où il est oxydé en NO3- par la leghémoglobine (Lb). Au cours de ce travail de thèse, mené sur le modèle Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti, nous avons d'abord montré que les nitrate réductases et les chaînes de transfert d'électron des deux partenaires, végétal et bactérien, sont impliquées dans la production de NO dans les nodosités fonctionnelles. Nous avons également montré que l'activité nitrate réductase est nécessaire au maintien d'un état énergétique élevé permettant la fixation de l'azote. Dans un second temps, nous avons entrepris de caractériser le transport du nitrite chez des mitochondries purifiées de racines. L’objectif était ensuite d’identifier un ou plusieurs candidats pour le transport du nitrite dans les mitochondries. Pour cela, sur la base d'homologies de séquence avec des transporteurs déjà identifiés et de séquences d'adressage putatives, une recherche in silico des protéines prédites de M. Truncatula a été conduite. Cette analyse a permit de sélectionner 6 candidats avec une localisation possible aux mitochondries. L’analyse par spectrométrie de masse des protéines présentes sur les membranes des mitochondries a révélé 3 autres candidats. L'expression des 9 candidats retenus a été caractérisée en situation de normoxie et d’hypoxie dans les racines et les nodosités. Cela a permis de mettre en évidence deux profils intéressants. Enfin, l'étude de l’adressage subcellulaire et l’expression tissulaire au cours du développement de la nodosité ont été débutés pour certains des candidats retenus sur leur profil d’expression et ceux obtenus par spectrométrie de masse.

  • Titre traduit

    "Nitrate-NO" respiration study in symbiotic interaction between Medicago truncatula and Sinorhizobium meliloti : searching for mitochondrial nitrite transporter


  • Résumé

    Symbiosis between legume plants and nitrogen-fixing bacteria (rhizobium) constitute a major issue to reduce nitrogen fertilization in crops. Central function of nodules is the enzymatic reduction of atmospheric nitrogen (N2) into ammoniac (NH4+) by the bacterial nitrogenise, and the subsequent assimilation in the plant cell. This highly energy-consuming process is a paradox as occurring in hypoxied tissue where mitochondrial respiration -the main ATP source- is strongly reduced. The question rose how the ATP required for cellular functioning is generated into nodules. Based on recent observations on hypoxied roots, we rose the hypothesis that, in nodules, ATP is formed trough a cyclic respiration -called nitrate-NO respiration- that consists in four steps: 1) nitrate reductase (NR) reduces nitrate (NO3-) into nitrite (NO2-) in the cytosol ; 2) NO2- is transported from cytosol into mitochondria using transporter(s) protein(s) ; 3) electrons of mitochondrial transfer chain reduces NO2- into nitric oxide (NO), thus allowing respiration functioning and ATP formation ; and 4) NO freely diffuses from mitochondria to cytosol to be oxidized back into NO3- through leghemoglobine (Lb) action. During this thesis, we showed, using Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti system as a model, that NRs and electron transfer chains from both plant and bacterial partners were involved in NO production of functioning nodules. NR activity was also showed to be crucial to maintain high energetic status required for nitrogen fixation. The second aim was to characterized nitrite transport across purified root mitochondria. Then, mitochondrial nitrite transporter candidate(s) were investigated. An in silico strategy searching for predicted proteins in M. Truncatula genome, potentially localized to mitochondria, that shared homologous sequences with known transporters was conducted. 6 candidates were chosen at the end of this analysis. Membrane mitochondria proteins were identified using mass spectrometry (MS) analysis, revealing 3 new candidates. The expression profile in normoxied and hypoxied roots and nodules was characterized for the 9 candidates retained. Two of them showed particularly promising patterns. Finally, sub-cellular localization and tissular expression during nodule development were analyzed for some candidates that shared interesting expression patterns.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (248 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 214-241. Résumés en français et en anglais

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  • Bibliothèque : Université Nice Sophia Antipolis. Service commun de la documentation. Section Sciences.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : 12NICE4099
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