Recherche des bases moléculaires de l’équilibre transglycosylation / hydrolyse d’une glycoside hydrolase de la famille 1

par David Teze

Thèse de doctorat en Biochimie, Enzymologie

Sous la direction de Michel Dion et de Huu Vinh Tran.

Soutenue en 2012

à Nantes , dans le cadre de École doctorale Biologie-Santé Nantes-Angers , en partenariat avec Université de Nantes. Faculté des sciences et des techniques (autre partenaire) .


  • Résumé

    Dans cette étude nous nous sommes intéressés à la β-glycosidase de Thermus thermophilus (Tt-β-gly), enzyme appartenant à la famille 1 des glycosides hydrolase (classification CAZY). Tt-β-gly catalyse les réactions d’hydrolyse et de transglycosylation de glycosides. Cette dernière présente un intérêt pour la synthèse d’oligosaccharides, qui sont des molécules difficiles à produire par voie chimique. L’évolution dirigée de cette enzyme avait été réalisée au laboratoire, permettant d’obtenir trois mutants à activité synthétique améliorée. Pour comprendre les bases moléculaires de cette amélioration nous avons caractérisé cinétiquement les mutants obtenus par évolution dirigée et avons résolu la structure cristallographique de deux d’entre eux. Nous en avons tiré une hypothèse sur l’effet des mutations qui pourrait se généraliser pour la création de transglycosidases par mutagenèse rationnelle. Ainsi, nous avons créé quatre nouveaux mutants qui présentent une activité synthétique améliorée, permettant de catalyser la formation de N(Me)-O-Bn-N-(β-D-fucopyranosyl(1→3)β-D-glucopyranosyl)hydroxylamine avec des rendements de 57 à 77% contre 36% pour Tt-β-gly native. D’un autre côté nous avons étudié la dynamique des molécules d’eau internes de la structure de Tt-β-gly, nous intéressant particulièrement à la recherche de « canaux d’eau » potentiels dans cette enzyme, susceptibles d’expliquer l’équilibre hydrolyse/transglycosylation. Nous avons pour cela combiné des approches de modélisation moléculaire et de suivi des échanges protons-deutérons par spectrométrie de masse (DXMS). Cette étude nous a permis d’identifier des canaux d’eau potentiels au sein de la structure de Tt-β-gly.

  • Titre traduit

    Molecular basis of the balance between transglycosylation and hydrolysis activity in a family 1 glycoside hydrolase


  • Résumé

    In this study we investigated the Thermus thermophilus β-glycosidase (Tt-β-Gly), an enzyme belonging to family 1 glycoside hydrolases (CAZy classification). Tt-β-gly catalyzes hydrolysis and transglycosylation of glycosides. The later is of particular interest for the synthesis of oligosaccharides which are extremely challenging to produce chemically. Directed evolution of this enzyme was carried out in the laboratory to obtain three mutants with improved synthetic activity. These mutants were characterized and the structures of two of them were determined by protein crystallography in order to understand the molecular basis of this improvement. We propose a working hypothesis about the effect of mutations in order to create new transglycosidases by rational mutagenesis. Thus, we created four new mutants that exhibit improved synthetic activity and allow the formation of N (Me)-O-Bn-N-(β-D-fucopyranosyl (1 → 3) β-D-glucopyranosyl) hydroxylamine with yields of 57-77% against only 36% when wild type Tt-β-Gly was used. On the other hand, we have studied the dynamics of internal water molecules in the Tt-β-Gly structure, particularly focusing on searching potential "water channels" in this enzyme, which may explain the transglycosylation over hydrolysis balance. For this, we combined molecular modeling approaches and monitoring of proton-deuteron exchange by mass spectrometry (DXMS). During this study we identified potential water channels within the Tt-β-Gly structure.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (188 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 166-182

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