Assessment of the allergenic potential of genetically modified wheats by comparison with their wild type genotypes and commonly grown cultivars through allergenomic and immunochemical approaches

par Roberta Lupi

Thèse de doctorat en Biologie, Médecine et santé. Biochimie, Biologie cellulaire et moléculaire. Physiologie et nutrition

  • Titre traduit

    Evaluation de l’impact de la transformation génétique sur l’allergénicité : comparaison des blés transgéniques et leurs génotypes cultivés, et différentes variétés de blé dur et tendre


  • Résumé

    Wheat is one of the world’s most popular and cultivated crops and is also one of the six majour foods allergens. The kernel proteins are typically classified according to their solubility properties into albumins (water soluble), globulins (salt soluble) and insoluble prolamins (gluten proteins). The salt-soluble fraction includes proteins with metabolic activity or structural functions, while gluten proteins are directly involved in wheat quality, and both fractions cause food allergy and Baker’s asthma. These proteins accounting for about 10-15% of the grain dry weight. Since allergies are a major health concern and seem increasing, much attention is now being focused on foods from genetically modified (GM) plants because of the postulated health risk. This concern includes the perception that the insertion of transgenes into host plant genomes may result in unpredicted effects on the expression of other genes and effects on plant phenotype (e. G. Increases in toxicity and allergy). If this is the case, transgenic crops could not be considered “substantially equivalent” to non-GM crops. The classical safety assessment of GM plants includes a direct comparison with the corresponding untrasformed genotype. Thus, the first approach carried out in this work was a comparison by pairs of GM wheat lines and their untransformed (wild type, wt) genotypes, followed by a with a larger group of cultivars. Two GM wheat lines (a durum and bread wheat) were compared to untransformed counterparts, first by Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA) with twentyone sera from patients suffering from food allergy to wheat and Baker’s asthma, and second by allergenomic approach. In particular we investigated a bread wheat line overexpressing a LMW-GS and a durum wheat line overexpressing the Wx-B1 gene. The comparison was focused on the albumins/globulins (A/G) fractions, because their amounts were changed as a result of the two transformation events. The results obtained by ELISA revealed significant differences for only two patients suffering from Baker’s asthma and for six patients affected from food allergy among the 21 tested. Thus, the concentrations of A/G specific IgE measured for GM bread wheat and its wt genotype and GM durum line and its wt genotype were comparable for 84% and 70% of sera. Two dimensional immunoblots were performed by using three sera from patients affected from food allergy and one serum from a patient with Baker’s asthma on A/G fractions of the two GM lines and their wt genotypes. Numerous IgE-binding polypeptides were detected for each genotype and the profiles of these reactive polypeptides between GM wheat and its untransformed genotypes were similar. Only few changes in allergenic profiles between the transgenic lines and their wt genotype were detected. Hundred nine spots were identified by mass spectrometry as IgE binding proteins; most of them have been already described as allergens or potential allergens, and few of them are peculiar either of the GM or the wt genotype. A comparison based on ELISA between the different water-salt soluble extracts obtained from a collection of GM wheat lines and commercial varieties of wheat obtained by conventional breeding methods was performed. Moreover, the different water-salt soluble extracts were compared by one dimensional immunoblots performed by using sera from patients allergic to wheat and specific anti-LTP antibodies. The IgEbinding polypeptides from different extracts were compared by mass spectrometry. The ELISA test showed a wide variation in the group corresponding to the commercial cultivars, and the differences detected between GM wheats and their wt genotypes were included in this range of variation. Moreover, the highest values were observed in commercial cultivars compared to the GM lines. These results showed that, at least for the GM genotypes here analysed, the differences in specific IgE concentrations can be considered within natural variation


  • Résumé

    Le blé est l’une des céréales les plus cultivées dans le monde mais aussi la plus largement consommée. Les deux génotypes majoritairement cultivés sont le blé tendre (génome AABBDD) et le blé dur (génome AABB). Le blé tendre est couramment utilisé sous forme de farine en panification, en biscuiterie, tandis que le blé dur est surtout utilisé pour la préparation des pâtes. Cependant, le blé fait partie des six principaux aliments connus pour être allergène pour les sujets susceptibles. Selon les génotypes, les protéines du grain représentent entre 10 et 15 % de sa matière sèche. Elles sont classiquement séparées en fonction de leurs propriétés de solubilité en albumines (hydrosolubles), globulines (solubles en solution saline) et prolamines insolubles (glutenines et gliadines, constituant le gluten). Les fractions solubles dans l’eau et les sels (Albumines/Globulines, A/G) sont principalement constituées de protéines présentant des fonctions métaboliques ou structurales, alors que les protéines du gluten sont des protéines de réserve directement impliquées dans la qualité du blé. Ces deux fractions sont à l’origine d’allergies alimentaires et respiratoires alors que la fraction A/G est plutôt impliquée dans l’allergie respiratoire, l’asthme du boulanger, qui est l’une des allergies professionnelles les plus fréquentes en France. Ces allergies sont liées à une réponse immunitaire dirigée contre un allergène (une protéine) et impliquant les anticorps de type IgE. Les allergies sont en augmentation et sont désormais considérées comme un problème important de santé publique. Les plantes génétiquement modifiées (GM) sont de plus en plus étudiées et certaines d’entre elles sont largement cultivées par exemple en Amérique du Nord et Sud mais pas en Europe. Elles entrent dès lors dans l’alimentation et peuvent représenter un risque pour la santé. En effet ces plantes génétiquement modifiées ne sont pas naturelles puisqu’on y a introduit un gène absent à l’état sauvage ou modifié l’expression d’un gène. Même si les cibles visées sont un gène unique, de nombreux travaux ont mis en évidence un impact plus ou moins important de ces transformations sur l’expression des autres gènes. Cet aspect retient beaucoup l’attention, aussi bien de la communauté scientifique que celle des consommateurs, et participe à leurs inquiétudes et leurs réticences vis à vis des plantes GM, essentiellement pour l’augmentation potentielle de la toxicité et/ou de l’allergénicité. Pour les pays où la commercialisation de produits dérivés de plantes GM est acceptée, le principe qui s’applique est le principe d’équivalence substantielle. Classiquement l'évaluation de la sécurité des plantes GM inclut une comparaison directe avec le génotype non-transformé correspondant la variabilité naturelle existante doit être également prise en compte. Ce projet de doctorat s’insère dans ce contexte, avec comme 'objectif principal d'établir si la transformation du blé augmente le risque d'allergie, étant donné que le blé est déjà un aliment allergénique. L’approche utilisée dans cette étude permettra d’augmenter les connaissances sur les protéines impliquées dans les allergies au blé, particulièrement celles présentes dans la fraction soluble, qui ont été moins étudiées que les protéines insolubles du gluten. Dans une première partie de la thèse, l'allergénicité des lignées de blé GM a été évaluée par une approche d'allergénomique et comparée à celle des génotypes parentaux. Dans une deuxième partie de la thèse, une étude plus large a été conduite pour comparer des lignées GM et leurs parents avec un groupe de variétés commerciales cultivées. Il s’agit d’observer si les variations d’allergénicité entre les blés GM et leurs parents sont du même ordre que celles existant entre des variétés obtenues par des méthodes de sélection conventionnelle. Deux lignées de blé transgéniques (une lignée de blé dur cv Svevo, et une de blé tendre cv Bobwhite) ont été comparées aux génotypes correspondant non transformées, d'abord par ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay) avec vingt-un sérums de patients souffrant d’allergie alimentaire au blé ou d'asthme du boulanger, puis par une approche d'allergénomique. Nous avons étudié une lignée de blé tendre sur-exprimant une sous-unité de gluténines de faible poids moléculaire (LMW-GS) et une lignée de blé dur sur-exprimant le gène Wx-B1 impliqué dans la synthèse de l’amylose. La comparaison de la teneur et de la composition en allergènes s’est focalisée sur les fractions albumines/globulines (A/G), car les transformations génétiques ont nettement modifié leurs quantités dans les blés GM : ont été changées suite aux transformations génétiques. En particulier, la fraction A/G de la lignée de blé tendre GM a diminué alors que celle de la lignée de blé dur transgénique montre une augmentation. Les résultats obtenus par ELISA ne montrent que peu de différences significatives entre les lignées GM et leurs parents respectifs; en effet, nous avons mesuré des concentrations en IgE spécifiques des A/G qui diffèrent entre les blés GM et leurs parents seulement pour deux patients souffrant d’asthme du boulanger et pour six patients souffrant d’allergie alimentaire parmi les 21 sérums testés. Malgré ces différences, les concentrations d’IgE spécifiques des A/G mesurées pour la lignée de blé tendre GM et son génotype cultivé sont comparables pour 84% des sérums, et pour 70% des sérums en ce qui concerne la ligné de blé dur GM et la variété cultivée correspondante. Des immunoblots bidimensionnels sur les fractions A/G des deux lignées GM et de leurs génotypes cultivés ont été réalisés avec trois sérums de patients allergiques alimentaires et un sérum d'un patient atteint d'asthme du boulanger. De nombreux polypeptides réagissant avec les IgE ont été détectés pour chaque génotype. Seulement quelques changements dans les profils de ces polypeptides réactifs ont été repérés entre les lignées transgéniques et leurs génotypes non transgéniques. Cent neuf spots ont été identifiés par spectrométrie de masse, la plupart d'entre eux ont été déjà décrits dans la littérature comme des allergènes ou allergènes potentiels, et peu d'entre eux sont spécifiques du génotype transgénique. Pour la seconde partie de la thèse, nous avons réuni une collection de lignées de blé GM (2 génotypes de blé tendre et trois de blé dur) et les variétés commerciales et nullségrégant correspondantes disponibles, ainsi que des blés tendres et des blés durs obtenus par des méthodes de sélection conventionnelle. Pour chaque blé, nous avons préparé différents extraits solubles : fractions A/G, Métaboliques et CM-like. Les concentrations en IgE spécifiques de chaque extrait ont été mesurées par ELISA dans les sérums de 24 patients allergiques alimentaires ou respiratoires au blé. De plus, les fractions A/G, Métaboliques et CM-like ont été comparés par immunoblots monodimensionnels en utilisant des sérums de patients allergiques au blé et des anticorps spécifiques anti-LTP. Les polypeptides reconnus par les IgE ont été identifiés par spectrométrie de masse. Les tests ELISA ont montré une large variation dans le groupe correspondant aux variétés commerciales cultivées, et les différences détectées entre les blés GM et leurs génotypes non-transformé sont inclues dans cette gamme de variation. De plus, les valeurs les plus hautes de concentrations en IgE spécifiques ont été observées parmi les variétés commerciales cultivées. Ces résultats ont montré que, au moins pour les génotypes transgéniques analysés ici, les concentrations en IgE spécifiques mesurées s’inscrivent dans la variation naturelle mesurée au sein des 20 variétés cultivées. Nous avons montré que l'allergénicité peut être soit augmentée soit diminuée selon la transformation, ce qui reflète un effet aléatoire de la transformation sur l’expression de gènes non ciblés. Même si l’étude est concentrée quelques lignées de blé transgéniques et ne permet donc pas de tirer une conclusion générale sur l'équivalence substantielle de blés transgéniques, elle montre clairement la nécessité d'effectuer des évaluations de risque au cas par cas. Il est important de réaliser toutes les évaluations nécessaires avant la commercialisation de lignées GM, pour contribuer à l'acceptabilité publique. Bien sûr ceci devrait être fait par des institutions de recherche publiques, indépendantes et non pas par des sociétés de biotechnologie, afin d’éviter les conflits d'intérêts.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (241 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Réf. bibliogr.

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