Caractérisation biochimique et cellulaire des enzymes clés du métabolisme des phospholipides chez Plasmodium falciparum

par Sweta Maheshwari

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Henri Vial, Clemens H.M. Kocken et de Rachel Cerdan.

Soutenue le 23-01-2012

à Montpellier 2 , dans le cadre de Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; ....-2014) , en partenariat avec UMR 5235 - DIMNP - Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques (laboratoire) .

Le président du jury était Alexis Valentin.

Les rapporteurs étaient Frédéric Bringaud, Magali Frugier.


  • Résumé

    Le développement du parasite Plasmodium falciparum, responsable du paludisme, nécessite la synthèse de phospholipides et plus particulièrement de phosphatidylcholine (PC) et phosphaditylethanolamine (PE) qui représentent environ 85% de la totalité des phospholidipes du parasite. Leur synthèse s'effectue principalement par les voies métaboliques de novo, voies de Kennedy, en trois étapes enzymatiques. Les enzymes CTP: phosphoethanolamine cytidylyltransferase (ECT) et CTP: phosphocholine cytidylyltransferase (CCT) catalysent les étapes limitantes des deux voies de biosynthèse de la PE et de la PC, respectivement. Ces deux enzymes sont essentielles à la survie du parasite murin, P. berghei et représentent ainsi des cibles thérapeutiques potentielles. La PfCCT est constituée de deux domaines cytidylyltranférases (CT) répétés alors que l'enzyme homologue chez l'homme est composée d'un seul domaine. En revanche, pour la ECT, la présence de deux domaines CT est retrouvée chez toutes les espèces mais les analyses de séquences et de structures ont montré que des résidus importants du site catalytique liant le substrat n'étaient pas conservés dans le domaine CT C-terminal de la PfECT. Ce travail a eu pour but de déterminer les propriétés enzymatiques et les caractéristiques cellulaires de la PfECT et de la PfCCT. Les paramètres cinétiques de ces enzymes ont été quantifiés in vitro à l'aide protéines recombinantes ainsi que sur les enzymes endogènes à l'aide d'extraits parasitaires. Grâce à l'utilisation de protéines recombinantes ponctuellement mutées, nous avons montré que seul le domaine CT N-terminal de la PfECT est catalytiquement actif. Chez P. falciparum, la PfECT et la PfCCT sont exprimées tout au long du cycle intra-érythrocytaire du parasite. La PfECT est présente dans la fraction soluble du parasite alors que la PfCCT apparait aussi bien dans la fraction soluble qu'insoluble. Des expériences d'immunofluorescence ont montré que la PfECT est cytosolique. L'ensemble des résultats présentés apportent un éclairage important sur les fonctions et les propriétés de ces deux cibles potentielles et constituent les premières étapes indispensables à l'élaboration d'une approche thérapeutique.

  • Titre traduit

    Biochemical and cellular characterization of key enzymes of Plasmodium falciparum phospholipid metabolism


  • Résumé

    Phospholipids are essential for the growth and development of Plasmodium falciparum malaria parasite. Phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) are its major structural phospholipids. This study focused on CTP: phosphoethanolamine cytidylyltransferase (ECT) and CTP: phosphocholine cytidylyltransferase (CCT) that catalyzes the rate-limiting steps of the de novo Kennedy pathways for PE and PC biosynthesis respectively. Both ECT and CCT are essential in the rodent malaria parasite P. berghei and constitute potential chemotherapeutic targets to fight against malaria. PfCCT consists of two very similar cytidylyltransferase (CT) domains whereas the human enzyme consists of only one CT domain. The presence of two CT domains in ECT seems to be widespread in all the organisms. Sequence and structural analysis showed that the C-terminal CT domain of ECT lacks key residues in the substrate binding motif. This study aimed at unravelling the enzymatic properties and cellular characteristics of PfECT and PfCCT enzymes. In addition, these studies addressed the key question if C-terminal CT domain of PfECT is catalytically active. Kinetic parameters of the enzymes were evaluated in vitro on native proteins as well as on recombinant proteins, the latter being produced in bacterial system. Cellular characterisation studies using polyclonal antisera showed that PfECT and PfCCT are expressed throughout the intra-erythrocytic life cycle of the parasite. PfECT is found mainly in soluble form in the parasite while PfCCT is present in soluble as well as insoluble forms in the parasite. Furthermore, immunofluorescence studies for PfECT revealed that it is mainly cytosolic. To assess the contribution of each CT domain to overall PfECT enzyme activity, recombinant PfECT mutants were generated by site-directed mutagenesis. Kinetic studies on these mutants indicated that the N-terminal CT domain was the only active domain of PfECT. Collectively, these results bring new insights into the kinetic and cellular properties of the enzymes and will pave the way in developing a future pharmacological approach.

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