Développement des méthodes de molécule unique pour la détection simultanée des interactions protéine-ADN et leur application à l'étude du mécanisme de translocation de SpoIIIE.

par Shreyasi Thakur

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Catherine Royer et de Marcelo Nollmann.

Le président du jury était Andrea Parmeggiani.

Le jury était composé de Catherine Royer, Andrea Parmeggiani.

Les rapporteurs étaient Sonia Trigueros, François Cornet.


  • Résumé

    Le transfert d'ADN chez les bactéries est un processus essentiel dans la ségrégation des chromosomes lors de la progression du cycle cellulaire et de nombreuses protéines sont impliquées dans ce processus. Parmi elles, on trouve la famille des protéines SpoIIIE / FtsK, et différentes fonctions leur ont été attribuées. SpoIIIE a été identifiée comme étant essentielle a la sporulation chez Bacillus subtilis. Au cours de la sporulation, un septum de division asymétrique se développe à proximité d'un pôle de la cellule et divise la cellule en deux compartiments : la préspore et la cellule mère. SpoIIIE est responsable de la translocation directionnelle de l'ADN de la cellule mère à la préspore. Ce transport implique l'interaction de SpoIIIE avec des séquences spécifiques qui sont distribuées de forme asymétrique le long des chromosomes (séquences de reconnaissance SpoIIIE ou SRS). Dans cette thèse, je développe des méthodes de molécule unique pour aborder les différents aspects des mécanismes de translocation de SpoIIIE. Cette thèse est divisée en trois sections : (1) les développements et de l'optimisation méthodologiques, (2) la caractérisation de sytox comme un nouveau colorant intercalant l ‘ADN pour les expériences en molécules uniques, et (3) l'utilisation de ces méthodes de molécules uniques pour tester les modèles de translocation d'ADN par SpoIIIE. Pour commencer, j'ai développé deux méthodes de détection et manipulation par molécules uniques: 1) le premier permet la visualisation simultanée de l'ADN et les protéines fluorescentes par microscopie TIRF et à épifluorescence, et (2) l'utilisation de pinces magnétiques dans une configuration transversale qui, couplée à la détection par fluorescence, permet la détection simultanée de l’ extension de l'ADN et la visualisation de la localisation des protéines. Au cours de la thèse, j'ai construit ces configurations optiques, les ai caractérisé, et optimisé. Deuxièmement, j’ai étudié le mécanisme de liaison et des propriétés de fluorescence de sytox, un nouveau colorant d’ADN. Plus précisément, j'ai déterminé que: (1) sytox se lie à l'ADN rapidement dans un processus en deux étapes séquentielles qui implique des interactions électrostatiques; (2) la dynamique rapide de liaison et de dissociation de sytox conduit à un taux extrêmement faible de photoblanchiment , (3) la dégradation de l'ADN par sytox est quatre fois inférieure à celle observée pour d'autres bis-intercalants, tels que YOYO-1, et 4) sytox est un intercalant d'ADN qui augmente la longueur de l'ADN de 43%, et n'affecte pas ses propriétés mécaniques (mesurée par la longueur de persistance). Enfin, pour observer l'interaction entre SpoIIIE et SRS, la protéine SpoIIIE a été chimiquement étiquetée et caractérisée. Substrats d'ADN contenant la séquence SRS ont été préparés et adaptés aux méthodes de molécule unique développées pendant ma thèse. L’observation directe des interactions SpoIIIE-SRS par ces méthodes ont permis de réfuter un des modèles existant.

  • Titre traduit

    Development of single-molecule methods for the simultaneous detection of protein-DNA interactions and their application to the study of the mechanism of DNA translocation by SpoIIIE


  • Résumé

    DNA contains the genetic information of cells. Several cellular processes, including chromosome segregation during cell division and sporulation, and plasmid conjugation require the transport of double-stranded DNA (dsDNA) within and between bacterial cells. SpoIIIE/FtsK/Tra are a family of ring-shaped, membrane-anchored, ATP-fueled, directional motors required to segregate DNA across membranes during sporulation, cell division and conjugation. In particular, SpoIIIE is responsible for packaging the chromosome inside the prespore during the process of sporulation in Bacillus subtilis. This transport is directional and requires that SpoIIIE recognizes highly-skewed octameric sequences (SpoIIIE Recognition Sequences, or SRS) sparsely distributed along the whole chromosome. In this thesis, I developed different single-molecule methods to investigate the molecular mechanism by which SpoIIIE-SRS interactions lead to directional DNA transport. This thesis is divided in three sections: methodological developments and optimization, characterization of sytox as a new intercalating dye for single molecule experiments, and the use of single molecule methods to test the models for directional DNA translocation by SpoIIIE. First, I developed two single molecule methods that involved 1) the simultaneous visualization of DNA and protein by using intercalating dyes and direct protein labels to detect the localization of SpoIIIE on DNA using TIRF and epi-fluorescence microscopy; and (2) the use of a transverse magnetic tweezers setup coupled to fluorescence detection to simultaneously detect DNA extension and visualize protein localization. I built these optical setups, characterized them, and optimized several parameters. Secondly, we investigated the binding mechanism and fluorescence properties of sytox, a new bright, low photo-damage, multi-color DNA labeling agent. Specifically, I determined that: (1) sytox binds DNA rapidly in a two-step sequential process that involves electrostatic interactions; (2) the fast dynamics of binding and unbinding of sytox leads to an extremely low photobleaching rate; (3) DNA degradation by sytox is four-fold lower than that observed for other bis-intercalators, such as YOYO-1; and 4) sytox is a DNA intercalator that increases the DNA length upon binding by 43 %, while not affecting its mechanical properties (measured by the persistence length). Finally, to observe SpoIIIE-SRS interactions, SpoIIIE was chemically labeled and characterized. DNA substrates containing SRS sequence were prepared suitable for the different single molecule approaches undertaken and also characterized. Observation of SpoIIIE-SRS interactions allowed us to conclude that: (1) in the absence of SRS, SpoIIIE can bind DNA non-specifically (2) this first binding event does not require threading through the DNA end or assembly of monomers but rather the binding of a hexamer from an open to a closed conformation, (3) in the presence of ATP, SpoIIIE translocates on DNA and is predominantly located in DNA ends, and (4) can often condense DNA by looping, reconstituting the activity observed in magnetic tweezers assays, (5) when SRS sequences are present, SpoIIIE is redistributed from non-specific sites by a diffusional or 3D looping mechanism and locates SRS sequences where it remains bound with a higher affinity than to non-specific sequences.

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