Analyses structurales et fonctionnelles de la protéine non-structurale 5A (NS5A) du virus de l’hépatite C

par Aurélie Badillo

Thèse de doctorat en Biochimie

Sous la direction de François Penin.

Soutenue le 26-11-2012

à Lyon 1 , dans le cadre de École Doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé. (Villeurbanne) , en partenariat avec Institut de biologie et chimie des protéines (IBCP) . Bases moléculaires et structurales des systèmes infectieux (bm2si) (laboratoire) .

Le président du jury était Sylvie Ricard-Blum.

Le jury était composé de Xavier Hanoulle, Véronique Receveur-Bréchot.

Les rapporteurs étaient Jean Dubuisson, Marc le Maire, Darius Moradpour.

mots clés

• Virus de l’hépatite C
• NS5A
• Protéine intrinsèquement désordonnée (IDP)
• Antiviraux
• Diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS)
• Dichroïsme circulaire
• Résonance plasmonique de surface (SPR)
• Titration calorimétrie isotherme (ITC)
• Virus de l'hépatite C
• Dichroïsme circulaire
• Antiviraux
• Résonance plasmonique de surface

Résumé

La protéine NS5A est essentielle pour la réplication et l'assemblage du virus de l'hépatite C (VHC), et elle constitue une cible thérapeutique prometteuse pour le développement d'antiviraux. Cependant, aucune fonction claire n'a encore été décrite pour NS5A, et les connaissances structurales restent limitées. Ainsi, nous avons caractérisé l'état intrinsèquement désordonné des domaines D2 et D3 de NS5A en décrivant leurs espaces conformationnels et leurs potentialités de repliement en combinant différentes méthodes biophysiques. Nous avons aussi mis en évidence la variabilité structurale du domaine D2 au sein des génotypes du VHC, ce qui pourrait être en rapport avec les différences de pathogénie et d'efficacité des thérapies observées selon les génotypes. L'interaction de D2 et D3 avec la cyclophiline humaine A (CypA) a été étudiée par résonance plasmonique de surface (SPR). Bien que des mutations au sein du domaine D2 rendent la réplication du VHC moins dépendante de la présence de CypA, ces mutations n'empêchent pas la liaison entre D2 et CypA. En revanche, elles induisent des perturbations structurales qui pourraient affecter la cinétique d'interconversion des conformères de D2. Nous avons montré par SPR que D2 et D3 interagissent avec le domaine de fixation à l'ADN du récepteur nucléaire FXR. Cette interaction pourrait inhiber la fixation de FXR sur sa cible ADN, suggérant une implication de NS5A dans la modulation de l'activité transcriptionnelle de ce récepteur nucléaire. L'ensemble de ces informations, nous a permis de proposer un modèle de la structure globale de NS5A permettant une meilleure compréhension des propriétés structurales et fonctionnelles de cette protéine énigmatique

mots clés

• Hepatitis C virus (HCV)
• Non structural protein 5A (NS5A)
• Intrinsically disordered protein (IDP)
• Antiviral drugs
• Small angle X-ray scattering (SAXS)
• Circular dichroism
• Surface plasmon resonance (SPR)
• Isothermal titration calorimetry (ITC)

Titre traduit

Structural and functional analysis of the non structural protein 5A (NS5A) from hepatitis C virus

Résumé

NS5A is essential for HCV replication and particle assembly, and constitutes a very promising drug target. However, no clear function has yet been described for NS5A, and structural knowledge remains limited. We characterized the intrinsically disordered nature of NS5A domains D2 and D3, and describe their folding propensity and their overall conformational behaviour by combining different biophysical methods. We also highlighted the structural variability of D2 domain in HCV genotypes, which might be correlated with the disparities observed between genotypes in terms of pathogenesis and efficiency of therapies. The interactions between D2 and D3 with human cyclophilin A (CypA) was analysed by surface plasmon resonance (SPR). We showed that mutations in the D2 domain conferring resistance of HCV replication to CypA inhibitors did not prevent the interaction between D2 and CypA. However, they induce structural perturbations that may affect the kinetics of conformers interconversion of D2. We also showed by SPR that D2 and D3 interact with the of DNA-binding domain of the nuclear receptor FXR (farnesoid X receptor alpha). This interaction reduce the binding of FXR to its DNA target, suggesting an involvement of NS5A in the modulation of the transcriptional activity of FXR. All this data led us to propose a model of the overall structure of NS5A, which provides a useful template for a better understanding of structural and functional properties of this enigmatic protein