Suivi quantitatif in situ d'interactions biomoléculaire par microscopie optique SEEC

par Ludovic Roussille

Thèse de doctorat en Physique

Sous la direction de Dominique Ausserré et de Sylvie Ricard-Blum.

Soutenue le 19-06-2012

à Le Mans , dans le cadre de École doctorale Matériaux, Matières, Molécules en Pays de la Loire (3MPL) (Le Mans) , en partenariat avec Laboratoire de physique de l'état condensé (Le Mans) (laboratoire) et de Laboratoire de physique de l'état condensé / LPEC (laboratoire) .

Le jury était composé de Guillaume Brotons.


  • Résumé

    La microscopie SEEC (Surface Enhanced Ellipsometric Contrast) est une technique inventée au mans, il y a une dizaine d’années. Elle permet de visualiser des objets de taille nanoscopique entre polariseur et analyseur croisés en utilisant les propriétés non dépolarisantes de surfaces multicouches. Jusqu’au début de la thèse, seules des observations à l’air étaient possibles. Le but de cette thèse a consisté à adapter cette technique à l’observation in-situ d’objets en immersion dans l’eau.Pour cela, il a fallu inventer de nouvelles surfaces propres à ce nouveau milieu. Les calculs ont montrés que des surfaces fines d’or révélaient un bon contraste pour des objets de 1 nm en immersion dans l’eau. Expérimentalement, nous avons montré que pour exploiter au maximum le contraste SEEC, il est nécessaire de modifier l’éclairage. En parallèle de ces travaux expérimentaux, de nouveaux calculs ont montrés que l’utilisation d’épaisseurs encore plus fines permettait de visualiser ces objets avec un bon contraste et sans aucune modification de l’éclairage. Nous avons appelé cette nouvelle technique : la microscopie CONE. Nous avons découvert deux modes de mesure. Après avoir réalisé des fonctionnalisations homogènes et hétérogènes des surfaces d’or. Ces surfaces ont été utilisées en résonance plasmonique de surface (SPR) pour l’étude de fixation de protéine (adsorption et immobilisation) puis d’interaction protéine/protéine. Ces expériences ont ensuite servies de référence pour évaluer les microscopies SEEC et CONE. Par cela, nous avons prouvé que ces microscopies présentent de forts intérêts pour la détection in-situ de protéines avec un faible coût.

  • Titre traduit

    In situ quantitative monitoring of biomolecular interactions by Surface Enhanced Ellipsometric Contrast (SEEC) microscopy


  • Résumé

    This thesis was supported by National Agency for Research with the project: ANR PNANO-07 SEEC. The Surface Enhanced Ellipsometric Contrast (SEEC) microscopy has invented in 2000 at Le Mans (France). This technique allows the visualization of nanoscopic object between crossed analyzer and polarizer. It’s possible if some special multilayer surfaces are used. There surfaces must have the particularity to not change the polarization of light during the reflection. Until the beginning of the project the SEEC microscopy was useful only for air observations. The goal of the thesis was to adapt this technique to observe on gold surfaces immerged in water and to compare the performance of the SEEC microscopy with Surface Plasmonique Resonance (SPR) in that configuration. The SPR is a biomolecular interaction study reference technique. SEEC microscopy lateral resolution was evaluate by fluorescence microscopy. Next, we realize two model experiments monitor in parallel by SEEC microscopy and by SPR: BSA immobilization and biotinylated IgG fixation by immobilized streptavidine. To compare measurements efficiently we did a huge preparation work (surface functionalizations and microfluidic) to have exactly same conditions in both techniques.Our results show SEEC microscopy cannot replace SPR for biomolecular interaction studies but it can be used as cheap immunological diagnostic technique. This work gives the path to follow on that direction.


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