Développement de nouveaux outils pour la détermination de la structure de macromolécules biologiques par diffraction aux rayons X : application aux protéines membranaires et aux grands complexes protéiques

par Romain Talon

Thèse de doctorat en Physique

Sous la direction de Eric Girard.

Soutenue le 06-06-2012

à Grenoble , dans le cadre de École doctorale physique (Grenoble) , en partenariat avec Institut de Biologie Structurale (équipe de recherche) .

Le président du jury était Giuseppe Zaccai.

Le jury était composé de Eric Girard, Andrew Thompson, Olivier Maury.

Les rapporteurs étaient Vincent Villeret, Daniel Picot.


  • Résumé

    Cette thèse concerne le développement de complexes de lanthanide et leur utilisation pour résoudre les structures de macromolécules biologiques par diffraction des rayons X, en particulier celles de protéines membranaires et de complexes protéiques de grande taille. Les complexes de lanthanide sont formés d’un atome de lanthanide et d’un ligand chimique qui assure une liaison non-covalente avec les surfaces protéiques. Introduits dans les cristaux de protéine, ces derniers constituent une sous-structure qui, déterminée par les méthodes de phasage de novo courantes, permet de résoudre la structure de la macromolécule d’intérêt. La première partie de ce travail de thèse est une étude menée sur la grande famille des complexes picolinates de lanthanide, complexes luminescents dont la fixation au sein des cristaux est aisément décelable. En premier lieu, nous avons défini les conditions dans lesquelles le complexe tris-dipicolinate de lanthanide peut être utilisé ainsi que ses éventuelles capacités à promouvoir la cristallisation (effet supramoléculaire). En second lieu, un nouveau complexe, dérivé du précédent, a été développé au cours de cette thèse : le tris-hydroxymethyltriazoledipicolinate de lanthanide (« [Ln(TDPA)3]3- »). Il nous a permis de réaliser un phasage de novo très précis conduisant à la détermination des structures du lysozyme de blanc d’œuf de poule et de la thaumatine de Thaumatococcus daniellii à haute résolution. Par ailleurs, différents ligands pour ce nouveau complexe ont été synthétisés par chimie-click, nous permettant de créer une panoplie de complexes uniques et des complexes hybrides. Nous avons montré que cette nouvelle famille de complexes présente une meilleure affinité pour les protéines permettant leur utilisation à de faibles concentrations. Les essais menés avec ces LnTDPA ont aussi permis d’entrevoir l’importance de la charge globale pour expliquer l’effet supramoléculaire. En troisième lieu, un tripicolinate cagé, le LnTNTPA, a également été évalué. Constitué d’une cage chimique de charge globale nulle, nous avons montré que ce nouveau complexe luminescent est le seul de cette famille picolinate qui puisse être utilisé en présence d’ions divalents. Dans la seconde partie de cette thèse, nous décrivons l’utilisation des complexes de lanthanide pour le phasage de protéines multimériques de grandes tailles par les méthodes de phasage de novo. Premièrement, la structure de l’aminopeptidase dodécamérique PhTET1-12s de 480 kDa a été déterminée à 4 Å de résolution à l’aide du tris-dipicolinate d’europium. Ceci nous a permis de démontrer que les complexes de lanthanide peuvent être utilisés pour obtenir un phasage précis, même à basse résolution. Deuxièmement, les complexes de lanthanide issus de l'imagerie médicale ont aussi permis de déterminer la structure de trois nouvelles enzymes homotétramériques de la famille des malate déshydrogénases. Ces structures permettent d’apporter de nouveaux éclaircissements sur l'adaptation halophile. Enfin, en utilisant ces enzymes en tant que bibliothèque de fonctions chimiques, nous avons pu mettre en place une nouvelle approche méthodologique pour comprendre finement les modes d'interaction des complexes de lanthanide.

  • Titre traduit

    Developement of new tools for biological macromolecular structure determination by X-ray diffraction : application to membrane proteins and to large protein complexes.


  • Résumé

    This thesis aims to develop lanthanide complexes for solving biological macromolecular structures, especially membrane proteins and large protein complexes. Lanthanide complexes are composed of a lanthanide atom and a chemical ligand, which provides non-covalent binding to protein surfaces. Incorporated in protein crystals, they make up the substructure, determined by the widely-used de novo phasing methods, needed for solving the whole protein structure. The first part of the present work shows a study of the luminescent lanthanide picolinate complexes family, easily detectable in protein crystals. First, we defined the conditions in which the known lanthanide tris-dipicolinate can be used and we examined its possible ability to promote protein crystallization (supramolecular effect). Secondly, a newly developed lanthanide tris hydroxymethyltriazoledipicolinate complex "[Ln(TDPA)3]3-", derived from this previous complex, allowed us to obtain a very precise de novo phasing for solving the high-resolution structure of the hen egg white lysozyme and the thaumatin from Thaumatococcus daniellii. Besides, various ligands for these new complexes were synthetized by click chemistry, enabling us to create both unique complexes outfit and hybrid complexes. We have shown that this new complexes family presents a better affinity for proteins allowing their use at very low concentrations. Tests conducted with those LnTDPA have also evidenced the importance of complex global charge to explain the supramolecular effect. Third, a caged tripicolinate, the LnTNTPA, was evaluated. Characterized by a neutrally charged chemical cage, we have shown that this new luminescent complex is the only one of the picolinate complexes family that can be used in the presence of divalent ions. In the second part of this thesis, we describe the use of lanthanide complexes for phasing large multimeric proteins by de novo phasing methods. First, the structure of the 480 kDa dodecameric aminopeptidase PhTET1-12s was solved at 4 Å resolution by using the europium tris-dipicolinate which demonstrates that the lanthanide complexes can be used to obtain an accurate phasing, even at low resolution. Secondly, the lanthanide complexes from medical imaging also helped to solve the structures of three new homotetrameric enzymes from the malate dehydrogenases family. Those structures provide new insights into halophilic adaptation. Finally, by using these enzymes as a library of chemical functions, we developed a new methodological approach for a better understanding of the precise binding modes of those lanthanide complexes.


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