Relations structure-fonction des transporteurs nucléotides

par Pankaj Panwar

Thèse de doctorat en Sciences de la vie

Sous la direction de Eva Pebay-Peyroula.

Soutenue le 26-01-2012

à Grenoble , dans le cadre de École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble) , en partenariat avec Institut de Biologie Structurale (équipe de recherche) .

Le président du jury était Andréa Dessen.

Le jury était composé de Eva Pebay-Peyroula, Norbert Rolland, M.r.n Murthy, François Dehez, Philippe Roux, Hervé Laroche.

Les rapporteurs étaient Bruno Miroux, Jean-jacques Lacapere, Christian Degache.


  • Résumé

    Le transporteur NTT1 est responsable pour l'import d'ATP dans les chloroplastes afin de maintenir le métabolisme en période d'activité réduite ou nulle de la photosynthèse. Cependant, le mécanisme moléculaire de ce transporteur est encore méconnu, essentiellement du à la difficulté de manipulation des protéines membranaires. Nous avons réussi à développer un protocole pour la production de ce transporteur, permettant une bon rendement de solubilisation et obtention de protéines purifiées pour des études structurales. Combinant des caractérisations biochimiques et biophysiques, nous avons pu identifier des conditions de préparation d'échantillons qui ont mené aux premiers cristaux. Afin d'étendre notre connaissance sur les transporteurs de nucléotides, nous avons également entrepris des études structurales et fonctionnelles sur AAC, le transporteur ADP/ATP des mitochondries. AAC et NTT1 appartiennent à des familles de protéines différentes mais ont des fonctions voisines. À partir de la première structure d'AAC déjà connue, nous avons recherché par des criblages in silico de nouvelles molécules se liant au transporteur de façon compétitive avec le nucléotide et pouvant ainsi inhiber le transport. Les outils de docking ont été mis en place et ont permis à partir d'une librairie de 75000 composés d'identifier 17 molécules. Ensuite, nous avons testés ces molécules expérimentalement et montré qu'une d'entre elles inhibent le transport. De plus, trois nouveaux analogues d'ADP ont également été identifiés comme inhibiteurs.

  • Titre traduit

    Structural and functional studies on nucleotide transporters


  • Résumé

    Chloroplast NTT1 mediates external supply of ATP in the plastids, which is pre- requisite for the maintenance of plastid metabolism during limited or missing photosynthetic activity. However, their molecular mechanism remains poorly understood, primarily due to the difficulty of producing and purifying functional recombinant forms of these transporters. We have successfully developed a protocol for the production of this transporter, that is compatible for efficient solubilization and good yield of purified protein. Combining biochemical and biophysical analyses, we could characterize the protein solution and identify conditions from which first crystals could be obtained. To further extend our work with nucleotide transporter, structural and functional studies on mitochondrial ADP/ATP carrier (AAC) have been performed. AAC and NTT1 belong to different families but exhibit similar functional features. To discover small-molecule inhibitors of AAC's transport for structural studies, virtual docking of compounds was performed into the AAC active site, using the already known structure of AAC. Docking tools were installed and screening a large library of 75,000 compounds allowed the identification of 17 molecules. The experimental binding assay for AAC, revealed that one of the compounds has inhibitory activity in the micromolar regime. In addition, 3 novel ADP analogues showing inhibitory effect against ATP transport of AAC have also been identified.


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