Caractérisation de l'intron de groupe II P1.LSU/2 en vue de son utilisation en ciblage génomique

par Madeleine Zerbato

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire

Sous la direction de Francisco Javier Perea.

Le président du jury était Agnès Delahodde.

Le jury était composé de Anne Galy.

Les rapporteurs étaient Fulvio Mavilio, François Michel.


  • Résumé

    En thérapie génique ex vivo, les vecteurs lentiviraux peuvent être utilisés pour transduire les progéniteurs hématopoïétiques. Mais l’utilisation de vecteurs intégratifs non site-spécifique peut conduire à une mutagénèse insertionnelle. J’ai évalué le niveau de transduction des progéniteurs hématopoïétiques en mesurant le nombre de copies de vecteur intégrées dans des colonies cellulaires isolées. Il a été montré que la fréquence des cellules transduites et la distribution du nombre de copies de vecteur intégrées peut dépendre des conditions expérimentales. L’utilisation de vecteurs ciblant l’insertion du transgène à un site précis du génome permettrait de surmonter les problèmes de génotoxicité. Les introns de groupe II sont des éléments génétiques auto-épissable mobiles pouvant d’intégrer à un site précis du génome. Ils sont utilisés en ciblage génomique chez les procaryotes, mais pas chez les eucaryotes, probablement dû à une activité catalytique limitée dans ces cellules. J’ai étudié l’intron de groupe II Pl.LSU/2 de Pylaiella littoralis, qui est le seul capable de s’auto-épisser à des concentrations très faibles de magnésium. La protéine codée par l’intron Pl.LSU/2 (IEP) exprimée chez Escherichia coli a été purifiée et a montré une activité de transcriptase inverse soit seule, soit associée à l’intron ARN. Il a été montré que l’intron Pl.LSU/2 peut s’épisser chez Saccharomyces cerevisiae et que l’efficacité de l’épissage est augmentée par l’activité maturase de l’IEP. Cependant, les transcrits épissés ne sont pas traduits, et l’épissage de l’intron n’a pas été démontré dans les cellules humaines, tout comme le homing de l’intron chez E. coli et S. cerevisiae.

  • Titre traduit

    Characterization of the P1.LSU/2 group II intron for its use in genomic targeting


  • Résumé

    In ex vivo hematopoietic gene therapy, lentiviral vectors can be used to transduce hematopoietic progenitors. However, the use of non site-specific integrating vectors may lead to insertional mutagenesis. I evaluated the level of transduction of hematopoietic progenitor cells at the single-cell level by measuring vector copy number in individual colony-forming cell units. It was shown that the frequency of transduced progenitor cells and the distribution of VCN in hematopoietic colonies may depend upon experimental conditions. Nevertheless, the use of vectors that can target the integration of the transgene into a specific-site of the host genome would overcome genotoxicity issues. I evaluated the use of a group II intron for genomic targeting. Group II introns are self-splicing mobile elements that can integrate into precise genomic locations by homing. Engineered group II introns are commonly used for targeted genomic modifications in prokaryotes but not in eukaryotes, probably due limited catalytic activation in these cells. I studied the brown algae Pylaiella littoralis Pl.LSU/2 group II intron which is uniquely capable of in vitro ribozyme activity at unusually low level of magnesium. Recombinant Pl.LSU/2 IEP expressed in Escherichia coli was purified and showed a reverse transcriptase activity either alone or associated with intronic RNA. The Pl.LSU/2 intron was showed to splice accurately in Saccharomyces cerevisiae and splicing efficiency was improved by the maturase activity of the intron-encoded protein. However, spliced transcripts were not expressed, and intron splicing was not detected in human cells, as well as homing of Pl.LSU/2 in E. coli and S. cerevisiae.


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