Développements méthodologiques pour la cristallisation et l'analyse structurale de protéines par Résonance Magnétique Nucléaire en phase solide

par Alessandro Marchetti

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Guido Pintacuda.

Le président du jury était Vincenzo Barone.

Le jury était composé de Guido Pintacuda, Vincenzo Barone, Philip Grandinetti, Hartmut Oschkinat, C. A. Veracini, Lyndon Emsley.

Les rapporteurs étaient Philip Grandinetti, Hartmut Oschkinat.


  • Résumé

    Malgré sa diffusion rapide dans le domaine des biomolécules, plusieurs problèmes restent à résoudre avant que la RMN du solide à haute résolution soit prête à faire face à des applications complexes. Afin d’étendre ses capacités, les objectifs de cette thèse sont de deux ordres: a) établir un nouveau système modèle, plus complexe que les petites protéines globulaires et b) développer de nouvelles expériences de RMN afin d'améliorer la sensibilité et la résolution des méthodes pour l'attribution de résonances. Le domaine N-terminale de l’unité de l'ADN polymérase III de E. coli a été choisi comme système cible. Les conditions de préparation de l’échantillon sont obtenues grâce aux processus de screening à haut débit, et l'attribution quasi exhaustive des résonances est effectuée par l'application des expériences bien établies basées sur les irradiations rf à haute puissance et la rotation à l'angle magique (MAS) à basse fréquence. Nous montrons que l'utilisation de vitesses à l'angle magique "ultra-rapides" (60 kHz) rend possible l'usage d'expériences aux "puissances faibles" affichant une augmentation extraordinaire de résolution et sensibilité, et permettant l'acquisition des transferts par polarisation croisée, des corrélations entre les liaisons chimiques et des corrélations détectées par 1H. Des faibles largeurs de pics sur les spectres 1H sont obtenues pour des échantillons de protéines entièrement protonées à l’état solide sans qu'une dilution dans un milieu deutéré soit nécessaire. La dernière partie de la thèse concerne l’étude de phases cristaux liquides (LX) thermotropes d'un smectogen de Vries , le dérivé (S)-hexyl-lactate, abrégé 9HL, sélectivement deutéré.

  • Titre traduit

    Methodological development for crystallization and strctural analysis of proteins by solid-state Nuclear Magnetic Resonance


  • Résumé

    Despite the rapid diffusion of solid-state NMR (ssNMR) in the area of biomolecules, its application is far away of being systemic, and many problems remain however tobe solved before it is applied to the study of challenging solid protein assemblies. In order to extend the capabilities of ssNMR to larger substrates, the objectives of this thesis are twofold: a) to establish a new, large and more complex model system, and b) to develop new, sophisticated NMR experiments in order to improve the sensitivity and the resolution of the currently existing schemes for resonance assignment. The N-terminal domain of the Polymerase subunit III of E. coli was chosen as a target system. Sample preparation conditions are obtained, notably in combination with automated screening processes, and almost complete resonance assignment is performed based on high-power rf irradiations and slow magic-angle spinning (MAS. We show that the use use of MAS at so-called ultra-fast spinning rates (60 kHz makes possible the use of "totally low power" experiments. This yields an extraordinary increase in resolution and sensitivity, enabling the acquisition of selective cross polarization (CP) transfers, through-bond correlations and 1H-detected correlations. Narrow 1H NMR line widths and robust backbone assignment can be obtained for fully protonated medium-size protein samples in the solid state under ultra-fast magic-angle spinning, without any need for dilution against a deuterated background. The final part of this thesis concerns the study of thermotropic liquid crystals (LX) phases of a de Vries smectogen, the (S)-hexyl-lactate derivative abbreviated as 9HL, selectively deuterated.

  • Titre traduit

    Sviluppi metodologici per la cristallizazione e l'analisi struttrale di proteine tramite Risonanza Magnetica Nucleare alle stato solido


  • Résumé

    Nonostante la rapida diffusione della RMN allo stato solido (ssNMR) nell’ambito delle biomolecule, molti problemi rimangono da risolvere prima che quest’ultima possa essere applicata ad applicazioni più complesse. Allo scopo di estendere le sue potenzialità, gli obiettivi di questa tesi sono duplici. a) stabilire un nuovo sistema modello, più complesso delle semplici proteine globulari e b) sviluppare nuovi e piu sofisticati esperimenti NMR al fine di migliorare la sensibilità e la risoluzione dei metodi attualmente esistenti per l'assegnazione delle risonanze. Il dominio N-terminale dell’unita ε della DNA Polimerasi III di E.Coli è stato scelto come sistema bersaglio. Le condizioni di preparazione del campione sono ottenute grazie a processi di screening ad alta capacita, e l’assegnazione quasi complete delle risonanze è effettuata tramite l’applicazione di esperimenti routinari basati su irradiazioni RF a alta potenza e rotazioni all’angolo magico a bassa frequenza. Mostriamo che l’utilizzo di rotazioni all’angolo magico “ultra-MAS” (60 kHz) rende possibile l’uso di esperimenti “a basse potenze” mostrando uno straordinario aumento di risoluzione e sensibilità, e permettendo l’acquisizione di trasferimenti di polarizzazione selettivi, di correlazioni scalari attraverso i legami chimici e di correlazioni acquisite al protone. Larghezze di linea sottili al protone sono ottenute per campioni di proteine interamente protonate allo stato solido senza che sia necessaria diluizione in ambiente deuterato. L’ultima parte della tesi riguarda lo studio di fasi liquido-cristalline termotropiche di uno smettogeno de Vries, il derivato dello (S)-esil-lattato, abbreviato come 9HL, selettivamente deuterato.

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