Exploration fonctionnelle et valorisation industrielle de la protéine de choc thermique bactérienne Lo18

par Florian Ronez

Thèse de doctorat en Sciences de la vie

Sous la direction de Jean Guzzo.

Soutenue le 24-04-2012

à Dijon , dans le cadre de École doctorale Environnements, Santé (Dijon) , en partenariat avec Procédés Alimentaires et Microbiologiques (Dijon) (laboratoire) .

Le président du jury était Nathalie Cayot.

Le jury était composé de Patrice Arbault, Jean-Luc Tholozan.

Les rapporteurs étaient Michel Hébraud, Joël Scher.


  • Résumé

    La bactérie lactique Oenococcus oeni qui fait partie de la flore d’intérêt du vin, est responsable de la fermentation malolactique. Au cours de son développement dans le vin, Oenococcus oeni est confronté à des conditions physicochimiques drastiques (présence d’éthanol, pH 3,5, basse température, présence de composés soufrés, …). Sa capacité à s’adapter à ces conditions défavorables en fait un bon modèle d’étude de la réponse à de multiples stress chez les bactéries lactiques (Guzzo et al., 2000). L’un des mécanismes de résistance d’O. oeni fait intervenir une protéine de choc thermique de faible masse moléculaire ou sHsp (small Heat shock protein) nommée Lo18. La protéine Lo18 possède une activité de chaperon ATP-indépendante. C'est-à-dire que son association avec une protéine en cours de dénaturation permet de protéger la protéine et d’empêcher son agrégation. De plus elle est capable de s’associer avec les bicouches lipidiques et de stabiliser la structure lipidique.Les sHsp se caractérisent par la présence d’une région d’environ 90 acides aminés appelée α-cristallin impliquée dans l’activité de chaperon moléculaire in vitro. En général, les extrémités N- et C- terminales jouent un rôle essentiel dans le processus d’oligomérisation qui est nécessaire à l’activité chaperon. Dans l’optique d’étudier la relation entre la structure et la fonction de la sHsp Lo18, son activité et son oligomérisation ont été caractérisées à différents pH. Les résultats ont montré que le pH influe sur l’oligomérisation de Lo18 et également son activité de chaperon moléculaire. Des protéines Lo18 modifiées dans le domaine α-cristallin ont également été caractérisées. Elles ont permis de démontrer qu’une substitution d’acide aminé dans ce domaine altère l’activité de Lo18. Enfin des formes tronquées de Lo18 pour ses deux portions N- et C- terminales ont été construites, surproduites chez Escherichia coli, puis purifiées par chromatographie d’affinité hydrophobe.La capacité de Lo18 à empêcher l’agrégation des protéines et à stabiliser les membranes lipidiques nous a conduit à tester l’impact de Lo18 d’une part sur la surproduction in vivo chez Escherichia coli de protéines hétérologues d’intérêt, et d’autre part sur la formation d’un caillé laitier riche en caséine et lipides.La surproduction hétérologue de protéines chez E. coli est utilisée pour produire de grandes quantités de protéines à faibles couts. Cependant cette production n’est pas toujours efficace car l’accumulation d’une même protéine dans la cellule de la bactérie conduit souvent à son agrégation et à sa dégradation. Il apparait nécessaire de développer des systèmes permettant d’améliorer la solubilité des protéines surproduites chez E. coli. Nous avons donc testé les potentialités de Lo18 dans ce système, et montré une augmentation de la solubilité de protéines d’intérêt coproduites avec la sHsp Lo18 et/ou la Hsp GroEL/ES.Le lait comporte quatre composants dominants : l’eau, les matières grasses, les protéines et le lactose. En technologie fromagère, la coagulation correspond à une déstabilisation de l’état micellaire des protéines majoritaires du lait: les caséines. La prise en gel est suivie d’une phase d'égouttage, la synérèse, qui correspond à la perte d’une partie du lactosérum hors du gel. Les propriétés de chaperon moléculaire de la protéine Lo18 ont permis d’influencer l’agrégation des caséines in vitro. Nous avons donc appliqué Lo18 au modèle caillé laitier et décelé des applications industrielles possibles. Nous avons notamment montré en laboratoire une accélération de la phase de prise en gel, et une accélération du processus de synérèse. En modèle fromager nous avons mis en évidence que Lo18 permet de diminuer le taux d’humidité dans les fromages de type « pâtes molles »

  • Titre traduit

    Exploration of the functions and valorisation in the industry of the bacterial small heat shock protein Lo18


  • Résumé

    The lactic acid bacteria Oenococcus oeni is part of the flora of interest in wine. It is responsible for malolactic fermentation. During its development in the wine, Oenococcus oeni is facing drastic physicochemical conditions (presence of ethanol, pH 3.5, low temperature, presence of sulfuric compounds). Its ability to adapt to these conditions makes of it a good model to study the response to multiple stress in lactic acid bacteria (Guzzo et al., 2000). One mechanism of resistance of O. oeni involves a Heat shock protein (Hsp) of low molecular weight or sHsp (small Heat shock protein) called Lo18.Lo18 protein has a chaperone activity ATP-independent. It is to say that its association with a protein during denaturation can protect the protein and prevent its aggregation. In addition Lo18 is able to bind with lipid bilayers and stabilize the lipidic structure.The sHsp are characterized by the presence of a region of about 90 amino acids, called α-crystallin, involved in molecular chaperone activity in vitro. In most cases, the N-and C-termini regions play an essential role in the oligomerization process that is necessary for the chaperone activity.In order to study the relationship between structure and function of Lo18, its activity and oligomerization were characterized at different pH. The results showed that the pH affects the oligomerization of Lo18 and also its molecular chaperone activity. Lo18 modified proteins in their α-crystallin region was also characterized. They have shown that a single amino acid substitution alters the activity of Lo18. Finally truncated forms of Lo18 in its two portions N-and C-termini were constructed, overproduced in Escherichia coli and purified by hydrophobic affinity chromatography.The ability of Lo18 to prevent aggregation of proteins and stabilize lipid membranes led us to test the impact of Lo18 for heterologous overproduction in Escherichia coli, and also in the formation of a curd milk rich in casein and fat.Overproduction of heterologous proteins in E. coli is widely used to produce large amounts of protein at low cost. However, this production is not easy because the accumulation of a protein in bacteria’s cell often leads to its aggregation and degradation. It appears necessary to develop systems to improve the solubility of proteins overproduced in E. coli. We therefore tested the potential of Lo18 in this system, and showed an increase in the solubility of proteins of interest coproduced with the sHsp Lo18 and / or the Hsp system GroEL / ES.Milk has four dominant components: water, fat, protein and lactose. In cheese technology, coagulation is a destabilization of the micellar state of the major proteins of milk: the caseins. Jellyfication phase is followed by a dripping phase called syneresis, which corresponds to the loss of part of the whey out of the gel.The properties of the sHsp Lo18 influenced the aggregation of the caseins in vitro. So we applied Lo18 on the curd milk model and detected possible industrial applications. In particular, we showed in laboratory an acceleration of the jellyfication phase, and an acceleration of the syneresis. In cheese model we have shown that Lo18 is able to reduce the humidity rate in cheeses

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