Stratégies synthétiques non conventionnelles de peptides contraints : modulation de la structure secondaire pour optimiser la reconnaissance biologique

par Chiara Testa

Thèse de doctorat en Chimie - Cergy

Soutenue le 26-03-2012

à Cergy-Pontoise en cotutelle avec dipartimento di chimica Ugo Schiff, Università di Firenze , dans le cadre de École doctorale Sciences et ingénierie (Cergy-Pontoise, Val d'Oise) , en partenariat avec Laboratoire de Chimie Biologique-LCB (Cergy-Pontoise, Val d'Oise) (laboratoire) .

Le jury était composé de Jacques Augé, Michael Chorev, Andrea Goti.

Les rapporteurs étaient Solange Lavielle.


  • Résumé

    La thèse porte sur le développement de stratégies non conventionnelles de peptides contraints et la modulation des structures secondaires pour augmenter la reconnaissance biologique de ces peptides.Les peptides jouent un rôle important dans de nombreux processus et sont donc d’un intérêt grandissant pour l’industrie pharmaceutique. Cependant, leur utilisation comme médicament reste limitée à cause de leur flexibilité conformationnelle, leur sensibilité aux protéases et leur faible biodisponibilité et pharmacodynamie. Dans ce contexte, la caractérisation des interactions ligands-récepteurs est cruciale pour comprendre les processus de reconnaissance et le design d’agonistes sélectifs, potentiels nouveaux médicaments. Ainsi, le développement d’outils portant des modifications structurales présente un intérêt grandissant pour trouver de nouveaux médicaments. Ces changements structuraux permettent d’affiner les conformations privilégiées et donc de comprendre la spécificité d’interactions par rapport à des sous-types de récepteurs ayant des propriétés physicochimiques et pharmacologiques particulières.Dans la première partie de ce travail, une stratégie optimisée pour la synthèse de fragments N-terminaux (1-34) de la séquence PTHrP.PTHrP(1-34)NH2 est décrite : H-Ala1-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp10-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg20-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu30-Ile-His-Thr-Ala-NH2. D’un point de vue synthètique, la formation de clusters dus à la présence de plusieurs résidus arginine, l’encombrement stérique, la longueur de la séquence et la présence de résidus hydrophobes dans la partie 19-28 du PTHrP rendent la synthèse difficile et donnent un enjeu important à la synthèse. C’est pourquoi, nous avons focalisé nos efforts sur l’optimisation du protocole opératoire. En particulier, nous avons montré l’intérêt d’utiliser une activation sous microondes pour la synthèse, avantages en termes de rendement et de pureté du peptide. La synthèse de PTHrP(1-34) a été optimisée à la fois sous activation par la temperature et sous microondes dans des conditions identiques. Les micoondes ont aussi été utilisé pour la synthèse de PTHrP(1-34)NH2. L’élongation de la chaine peptidique a été suivie par l’analyse UPLC-ESI-MS des fragments obtenus après micro clivage assisté par micro ondes. Cette stratégie nopus a permis , à travers la caractérisation des séquences délétées, d’identifier les points critiques de la synthèse, nécessitant les microondes. Dans la seconde partie de la thèse, ont été entreprises le design et la synthèse d’une série de cyclopeptides (i-to-i+5) 1,4- et 4,1-disubstitués pontés par un triazole, analogues de MTII. MTII, Ac-Nle4-c[Asp5-D-Phe7-Lys10]αMSH4-10-NH2 est un super agoniste agissant d’une manière non sélective des récepteurs de la mélanocortine MC1R, MC3R, MC4s, et MC5s. Ce peptide est caractérisé par un lien lactame entre les résidus Asp5 et Lys 10 stabilisant une structure β-turn, cruciale pour l’activité.Cependant MTII n’est pas sélectif des différents sous-type des récepteurs de la mélanocortine. L’importance particulière du système mélanocortine souligne le besoin de trouvé des analogues plus sélectifs, présentant une meilleure pharmacocinétique et une meilleure biodisponibilité. L’introduction du triazole [1,2,3] utilise dans nos analogues vise à stabiliser une conformation , à la place du lien lactame de MTII. La diversité est apportée par une variation de la position du triazole de i à i+5. Il est obtenu par une cycloaddition alcyne/azoture catalysée par le Cu(I) (CuAAC), générant très sélectivement l’adduit 1,4. Les analogues clickés de MTII présentant une position différente du triazole ont été synthétisé en phase solide et en solution. Les études conformationnelles et biologiques ont été conduites pour identifier l’analogue présentant la meilleure conformation β-turn conduisant à la meilleure activité biologique.

  • Titre traduit

    Non conventional synthetic strategies of stapled peptides : modulation of secondary structures to optimise biological recognition


  • Résumé

    PhD Thesis of Chiara TESTANon conventional synthetic strategies of stapled peptides: modulation of secondary structures to optimise biological recognitionPeptides play an important role in many biologically relevant processes and are of outstanding interest in pharmaceutical research. However their use as drugs is limited by their conformational flexibility, instability to proteases, poor oral bioavailability, and pharmacodynamics. In this contest the characterization of ligand-receptor interactions is crucial to understand the biological processes and to design potent and selective agonist, which could be used as new drug candidates.Therefore, the development of an expansive toolbox of structural modifications that can be used to fine tune the predominant conformations to achieve modulation of specificity toward receptor subtypes, physicochemical and pharmacological properties continues to be of great interest in the development of peptide-based drugs.In the first part of the work it is described an optimized strategy for the synthesis of the N-terminal fragments (1-34) of PTHrP.PTHrP(1-34)NH2 sequence is: H-Ala1-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp10-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg20-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu30-Ile-His-Thr-Ala-NH2. Considering the presence of clusters of arginines, sterically hindered and hydrophobic amino acid residues in the 19-28 sequence of PTHrP, and the considerable length of the peptide, the synthesis of PTHrP(1-34)NH2 is quite challenging. Therefore we focused our effort in the optimization of a synthetic protocol for this peptide. In particular, we showed the advantages that the use of microwaves have, in obtaining the best results in terms of yield and purity of the final peptide. The synthesis of PTHrP(1-34) was performed following the conventional RT and the MW-assisted SPPS protocol. In both cases the synthesis was performed using the same instrument, the same excess of reagents and molar ratios.Microwaves have also been used to monitor the synthesis of the peptide PTHrP(1-34)NH2. In fact, during the elongation of the peptide chain were analyzed by UPLC-ESI-MS intermediate fragments obtained through micro-cleavages assisted by microwaves. This strategy has allowed us, through the characterization of sequences of deletion, to understand what are the critical points of the synthesis that may require the use of microwaves.In the second part of the thesis we reported the design and the synthesis of a series of (i-to-i+5) 1,4- and 4,1-disubstituted [1,2,3]triazole-bridged cyclopeptides, derived from the scaffold of MTII. MTII, Ac-Nle4-c[Asp5-D-Phe7-Lys10]αMSH4-10-NH2, is a potent long acting non-selective super-agonist of melanocortin receptors MC1R, MC3R, MC4s, and MC5s. This peptide is characterized by lactam bridge between residues Asp5 and Lys10 stabilizing a type-II β-turn structure, that is critical for its bioactivity. Nevertheless, MTII is not selective for the different subtype of melanocortin receptors. The particular importance of melanocortin system, underscores the unmet need for highly selective, pharmacokinetically diverse, and bioavailable agonists and antagonists analogs. The introduction of [1,2,3]triazole was aimed to stabilize a β-turn conformation replacing the lactam bridge of MTII with an i-to-i+5 side chain-to-side chain cyclization via CuI-catalyzed azido-to-alkyne 1,3-dipolar cycloaddition (CuAAC) generating 1,4- or 4,1-disubstituted [1,2,3]triazolyl-containing ring structures. Clicked MT-II analogs presenting different permutations of bridges, containing 4 or 5 methylenes, and a triazolyl moiety were synthesized by a combination of solid phase assembly of the peptide and in solution CuAAC. Conformational and biological studies were performed on the peptides synthesized to identify the location and direction of the [1,2,3]triazolyl in the bridge that best reproduce the β-turn conformation leading to highly potent and sel


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