Etude du système de communication cellulaire NprR-NprX au sein du groupe Bacillus cereus

par Thomas Dubois

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Didier Lereclus.

Le président du jury était Isabelle Martin-Verstraete.

Le jury était composé de Didier Lereclus, Patrick Stragier, Gilles Vergnaud.

Les rapporteurs étaient Alain Givaudan, Pascale Serror.


  • Résumé

    Chez les bactéries sporulantes du genre Bacillus, des mécanismes importants tels que la sporulation et la virulence sont régulés par des systèmes de communication cellulaire qui impliquent des peptides de signalisation et des régulateurs de la famille RNPP (Rap, NprR, PlcR, PrgX). L'objectif de mon travail de thèse a été de déterminer le rôle du régulateur NprR chez les bactéries du groupe B. cereus. Ce travail se divise en trois parties complémentaires. La première partie a consisté à montrer que NprR est impliqué dans un système de communication cellulaire. Nous avons montré que NprR est un régulateur transcriptionnel de début de phase stationnaire qui est dépendant du peptide de signalisation NprX. Associé à NprX, NprR active la transcription du gène nprA qui code pour une protéase extracellulaire. Nous avons démontré que le peptide NprX est sécrété, maturé puis réimporté dans la cellule bactérienne par deux systèmes d'oligopeptide perméase (Opp et Npp). Une fois dans la cellule, la forme mature de NprX (vraisemblablement l'heptapeptide SKPDIVG) se lie à NprR et permet la transcription du gène nprA. Nous avons ensuite cherché à déterminer la fonction de ce régulateur au cours du cycle infectieux de B. thuringiensis (Bt) chez l'insecte. Nous avons montré que NprR est actif après la mort de l'insecte et permet aux bactéries de survivre, sous forme de cellules végétatives, dans les cadavres. Une analyse transcriptomique indique que NprR régule l'expression d'au moins 41 gènes qui codent notamment pour des enzymes dégradatives et un locus de gènes impliqués dans la production d'un peptide synthétisé de façon non ribosomique (la kurstakine). Nous avons démontré que les gènes codant pour les enzymes dégradatives s'expriment spécifiquement après la mort de l'hôte et que les produits de ces gènes sont essentiels pour hydrolyser différents substrats (protéines, lipides, chitine), ce qui suggère que Bt a un mode de vie nécrotrophe dans le cadavre. La kurstakine est essentielle pour la survie de Bt pendant son développement nécrotrophe et nous avons montré que cette molécule est nécessaire pour le swarming et la formation de biofilm. Par ailleurs, un mutant du gène nprR ne se développe pas et ne sporule pas efficacement dans le cadavre. L'ensemble de nos résultats indiquent que le necrotrophisme est un mode de vie hautement régulé, qui est essentiel dans le cycle infectieux de Bt car il contribue à la transmission horizontale de ce micro-organisme. Enfin, nous avons étudié la régulation de l'expression des gènes nprR et nprX. Nous avons montré que les gènes nprR-nprX sont co-transcrits à partir d'un promoteur dépendant de sigma-A (PA) situé en amont du gène nprR. La transcription à partir de ce promoteur débute lors de l'entrée en phase stationnaire et est contrôlée par deux régulateurs transcriptionnels: CodY et PlcR. Le répresseur CodY pourrait se lier à l'ADN en amont du promoteur PA et réprimer la transcription des gènes nprR-nprX pendant la phase exponentielle de croissance. Au début de la phase stationnaire, le contrôle négatif de CodY est levé et PlcR active la transcription de nprR-nprX en se liant à une boîte PlcR située en amont de PA. Nos résultats indiquent que nprX est également transcrit indépendamment de nprR à partir de deux promoteurs, PH et PE, respectivement dépendant de sigma-H et sigma-E. Les deux promoteurs permettent d'assurer la transcription de nprX en phase stationnaire tardive alors que la transcription à partir du promoteur PA est achevée. Cette étude met en évidence le role clé des régulateurs CodY, PlcR and Spo0A dans la régulation de l'expression des gènes nprR-nprX.

  • Titre traduit

    Study of the cell-cell communication system NprR-NprX in the Bacillus cereus group


  • Résumé

    In sporulating Bacillus, major processes like virulence gene expression and sporulation are regulated by communication systems involving signaling peptides and regulators of the RNPP family. In this work, we investigated the role of one such regulator, NprR, in bacteria of the Bacillus cereus group. This work can be divided into three complementary parts.The first part consisted to demonstrate that NprR is involved in a quorum-sensing system. We showed that NprR is a transcriptional regulator whose activity depends on the NprX signalling peptide. In association with NprX, NprR activates the transcription of an extracellular protease gene (nprA) during the first stage of the sporulation process. We demonstrated that the NprX peptide is secreted, processed and then reimported within the bacterial cell by two oligopeptide permease systems (Opp and Npp). Once inside the cell, the mature form of NprX, presumably the SKPDIVG heptapeptide, directly binds to NprR allowing nprA transcription. The second part was to explore the function of NprR during the infectious cycle of B. thuringiensis (Bt). We showed that NprR is active after death of the insect and allows Bt to survive in the cadavers as vegetative cells. Transcriptomic analysis revealed that NprR regulates at least 41 genes encoding degradative enzymes or involved in the synthesis of a non-ribosomal peptide named kurstakin. The degradative enzymes include chitinases, proteases and lipases. The corresponding genes are specifically expressed after host death suggesting that Bt has an active necrotrophic lifestyle in the cadaver. We showed that kurstakin is essential for Bt survival during necrotrophic development. It is required for swarming mobility and biofilm formation, presumably through a pore forming activity. A nprR deficient mutant does not develop necrotrophically and does not sporulate efficiently in the cadaver. Altogether, our results show that necrotrophism is a highly regulated mechanism essential for the Bt infectious cycle, contributing to horizontal transmission. Finally, the last part of my PhD consisted to study the regulation of nprR and nprX expression. We showed that the nprR-nprX genes are cotranscribed from a sigma A-dependent promoter (PA) located upstream from nprR. The transcription from PA starts at the onset of the stationary phase and is controlled by two transcriptional regulators: CodY and PlcR. The nutritional repressor CodY binds a DNA target site upstream from PA and represses nprR-nprX transcription during the exponential growth phase. At the onset of the stationary phase, the negative control of CodY is relieved and PlcR activates nprR-nprX transcription by binding a PlcR box located upstream from PA. We showed that nprX is also transcribed independently of the nprR transcription from two promoters, PH and PE, dependent on sigma-H and sigma-E, respectively. Both promoters ensure nprX transcription during late stationary phase and sporulation while transcription from PA is complete. This study highlights the key role played by CodY, PlcR and Spo0A in nprR-nprX transcription.


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